陶昌勇

(滁州城市職業(yè)學(xué)院，安徽 滁州 239000)

肌肉生長主要依賴于肌衛(wèi)星細胞增殖分化，導(dǎo)致肌纖維長度和周徑增加.研究證實生肌過程主要由生肌決定因子家族(MRFs)、心肌細胞增強子家族(MEF2s)和肌肉生長抑制蛋白myostatin(MSTN)調(diào)控.MSTN作為轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)家族成員之一，具有此家族的典型結(jié)構(gòu)特點.研究發(fā)現(xiàn)MSTN在骨骼肌內(nèi)大量表達，可以負(fù)向調(diào)控肌肉發(fā)生[1].MSTN先與活化素受體蛋白ⅡB(ActRⅡB)結(jié)合，增加Smad2/3介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，抑制肌肉生長[2].大量研究發(fā)現(xiàn)，抑制MSTN通路可以促進肌肉生長，如敲除基因MSTN或是注入MSTN抗體或抑制其與ActRⅡB結(jié)合等均可以誘導(dǎo)肌肉生長[3-4],而過表達MSTN則導(dǎo)致小鼠骨骼肌萎縮[5].MSTN通路表達異常會影響肌肉質(zhì)量.

Mighty基因是Marshall等[6]在2008年通過小鼠消減抑制雜交文庫篩選出的MSTN下游直接調(diào)控基因，填補了MSTN調(diào)控肌肉生成上下游基因的空缺，可以作為MSTN通路的標(biāo)記因子.有研究發(fā)現(xiàn)急性抗阻運動可以抑制MSTN的轉(zhuǎn)錄[7]，但目前為止，并無急性抗阻運動對Mighty基因影響的研究.在肌衛(wèi)星細胞和骨骼肌重塑的研究中發(fā)現(xiàn)Notch信號通路可以通過抑制TGF-β通路調(diào)節(jié)肌肉生長[8].MSTN作為TGF-β成員之一，Mighty是MSTN調(diào)控肌肉生長的關(guān)鍵因子，急性抗阻運動是否也是通過Notch信號通路來抑制Mighty的轉(zhuǎn)錄呢？為此，本研究將檢測急性抗阻運動后24 h內(nèi)小鼠腓腸肌Notch信號通路和Mighty基因的動態(tài)變化，探討急性抗阻運動對Mighty的影響及其可能的調(diào)節(jié)機制.

1 材料和方法

1.1 動物及分組

健康雄性5周齡C57BL/6小鼠30只，體重 19.53±2.06 g，購于西普爾-必凱實驗動物中心，常規(guī)分籠飼養(yǎng)，每籠6只，自由飲食飲水，溫度22±2 ℃，濕度40%～60%.隨機分為5組：對照組(C)、運動后即刻組(E0)、運動后6 h組(E6)、運動后12 h組(E12)、運動后24 h組(E24)，每組6只.

1.2 運動模型

運動組進行負(fù)重爬梯訓(xùn)練.將爬梯放置成80°的斜面，將小鼠置于爬梯底端，從輕搖爬梯促使小鼠爬梯，至其自愿連續(xù)爬梯至頂端，使小鼠熟悉爬梯.適應(yīng)性訓(xùn)練時，小鼠尾部負(fù)重爬梯，從爬梯底端到頂端后休息1～2 min，然后將小鼠再次置于底端，促使其攀爬，每6次為一個單元，每天進行2個單元的訓(xùn)練，2個單元之間間隔20 min.負(fù)荷分別為小鼠自身體重的25%、50%、75%、100%，進行遞增負(fù)荷的適應(yīng)性訓(xùn)練，為期7 d.第1 d 2個單元訓(xùn)練均負(fù)重25%體重；第2 d第1單元負(fù)重25%體重，第2單元負(fù)重50%體重；第3 d 2個單元均負(fù)重50%體重；第4 d第1單元負(fù)重50%體重，第2單元負(fù)重75%體重.以此類推，負(fù)重直至達到100%體重(具體方案如表1所示).然后以自身體重100%負(fù)荷進行正式負(fù)重爬梯運動，方案與第7 d一致，為期1天.對照組置于爬梯上自由活動.

表1 小鼠負(fù)重爬梯運動適應(yīng)性訓(xùn)練表/%

1.3 取材

小鼠進行1次正式負(fù)重爬梯運動后即刻、6 h、12 h、24 h，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠，斷頭處死，取左右側(cè)腓腸肌，標(biāo)記后置于液氮中.取材完畢轉(zhuǎn)移入-80 ℃冰箱，待測PCR及Western Blot.

1.4 RT-PCR檢測腓腸肌內(nèi)MSTN和Mighty mRNA的表達

取適量腓腸肌組織，使用Trizol法提取小鼠腓腸肌內(nèi)總RNA，以20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，37 ℃，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15 min；98 ℃，酶失活反應(yīng)5 min.得到的cDNA保存于-20 ℃.據(jù)RT-PCR試劑盒說明進行如下操作：加入10 μL SYBR green PCR Master Mix，ROX 0.4 μL，上下游引物各0.04 μL，2 μL cDNA，補充dH2O至20 μL.MSTN上游引物：5'-TAGCAGATTCAATAGTGGTC-3'；下游引物：5'-ATTGAAATTTGACTGGGAGC-3'；Mighty上游引物：5'-TGAAGCGGCCCATGGAGTTC-3'；下游引物：5'-TTGGCCTTGTCCCGTATCGC-3'；β-actin上游引物：5'-CTCTTTTCCAGCCTTCCTTCT-3'；下游引物：5'-TGGAAGGTGGACAGTGAGG-3'.按RT-PCR擴增循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性95 ℃，1 min；以95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，45 s為一循環(huán)，進行40個循環(huán)，記錄Ct值，根據(jù)2-△△Ct法計算相對表達量.

1.5 Western Blot檢測腓腸肌內(nèi)NICD蛋白水平

以每20 mg組織加入100～200 uL的含PMSF的Western裂解液中混勻，置于瓷珠勻漿儀中勻漿，冰上靜置10 min，重復(fù)2～4次.12 000 g離心3～5 min(4 ℃)，取上清，置于-80 ℃冰箱待測.根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒步驟(碧云天)，測定蛋白的含量.采用SDS-PAGE電泳將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上.2 h封閉后加入一抗(NICD，1∶500，c-23 307，santa)，4 ℃下?lián)u床孵育過夜.次日加入二抗(HRP，IgG，1∶1 000，碧云天)，室溫?fù)u床孵育2 h.TBST搖床洗10 min×3次，使用ECL發(fā)光顯影(避光)，Alpha凝膠成像系統(tǒng)自動曝光，捕捉圖像，Image J1.46進行灰度值分析，將NICD蛋白與內(nèi)參蛋白的平均密度之比作為NICD的相對表達水平.

1.6 統(tǒng)計分析

使用SPSS進行統(tǒng)計學(xué)分析計算，數(shù)據(jù)處理使用單因素方差分析，p﹤0.05：顯著性差異，p﹤0.01：極顯著性差異.所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示.

2 實驗結(jié)果

2.1 急性抗阻運動對小鼠腓腸肌Mighty和MSTN基因表達的影響

如圖1所示，與對照組比較，運動組小鼠腓腸肌內(nèi)Mighty mRNA表達在急性抗阻運動后即刻開始上升，但沒有顯著性差異(p>0.05)，在運動后6 h時出現(xiàn)了顯著性差異(p<0.05)，運動后12 h Mighty mRNA達到峰值(p<0.05)，隨后開始下降，但在運動后24 h也有顯著性差異(p<0.05).

如圖2所示，與對照組比較，運動組小鼠腓腸肌內(nèi)MSTN mRNA水平在急性抗阻運動后即刻開始下降，此時并無顯著性差異(p>0.05)，運動后6 h下降到最低并出現(xiàn)顯著性差異(p<0.05)，隨后開始上升，在運動后12 h也出現(xiàn)顯著性差異(p<0.05)，但在運動后24 h無顯著性差異(p>0.05).

2.2 急性抗阻運動對小鼠腓腸肌Notch信號通路的影響

與對照組比較，急性抗阻運動后即刻小鼠腓腸肌內(nèi)NICD表達上調(diào)，并出現(xiàn)顯著性差異(p<0.05)，此現(xiàn)象一直持續(xù)到運動后6 h(p<0.05)，在運動后12 h、24 h并無顯著性差異(p>0.05)(見圖3和圖4).

圖1 急性抗阻運動對Mighty mRNA表達的影響

圖2 急性抗阻運動對MSTN mRNA表達的影響

圖3 NICD Western Blot 檢測圖

圖4 急性抗阻運動對小鼠腓腸肌NICD蛋白水平的影響

3 分析和討論

運動訓(xùn)練可以引起骨骼肌肌纖維體積增大，肌肉蛋白質(zhì)代謝加強等適應(yīng)性變化.本實驗采用了急性抗阻運動，是據(jù)Troy[9]等的訓(xùn)練方法略作修改而得.Troy等發(fā)現(xiàn)8周的負(fù)重爬梯訓(xùn)練促進了肌纖維生長，誘導(dǎo)了肌肉肥大.而本實驗采用了急性負(fù)重爬梯訓(xùn)練，雖然一次抗阻運動可能對肌肉蛋白質(zhì)代謝的作用并不明顯，但是長期運動也是急性運動累積的結(jié)果.本實驗檢測急性抗阻運動后即刻、6 h、12 h、24 h等時間點Mighty、MSTN以及Notch信號通路的變化，探討了急性運動后骨骼肌內(nèi)各因子的動態(tài)變化，為長期運動誘導(dǎo)肌肉肥大提供了理論基礎(chǔ).

Mighty是2008年由Marshall等發(fā)現(xiàn)的MSTN下游直接調(diào)控基因，可以反映MSTN信號通路的轉(zhuǎn)錄活性，但是目前國內(nèi)并無研究人員進行運動后Mighty基因變化的研究.本研究發(fā)現(xiàn)急性抗阻運動后Mighty mRNA開始增加，在運動后6 h時出現(xiàn)了顯著性差異，運動后12 h達到峰值，盡管隨后有所下降，但運動后24 h仍具有顯著性差異.提示，急性抗阻運動可以上調(diào)小鼠腓腸肌內(nèi)Mighty基因的表達.在C2C12細胞中過表達Mighty可以導(dǎo)致細胞周期提前退出，p21、MyoD、MyoG、MyHC等肌肉分化標(biāo)記因子增強，融合指數(shù)顯著上升，形成肥大的肌管[10].而在mdx小鼠(肌營養(yǎng)不良小鼠模型)中過表達Mighty可以增加脛骨前肌纖維橫截面積.提示，外源性補充Mighty可以促進肌細胞分化導(dǎo)致骨骼肌肥大.本實驗通過負(fù)重爬梯訓(xùn)練，觀察到小鼠骨骼肌內(nèi)Mighty表達增加，說明抗阻運動可能通過提高Mighty表達來促進肌肉肥大，但是由于本實驗采用急性抗阻運動，并沒有從宏觀上檢測骨骼肌質(zhì)量的變化，今后將繼續(xù)進行長期抗阻運動對Mighty表達及骨骼肌質(zhì)量的影響.

本研究同樣檢測了急性抗阻運動后24 h內(nèi)MSTN基因表達的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)運動后即刻MSTN表達開始減少，在運動后6 h降到最低，隨后開始上升，12 h仍具顯著性差異，但在24 h時MSTN表達與對照組無顯著性差異，提示急性抗阻運動后MSTN表達受到抑制.賀道遠等[11]研究了急性跑臺運動對大鼠骨骼肌MSTN mRNA表達的影響，發(fā)現(xiàn)急性運動后大鼠骨骼肌MSTN表達下降.張靚等[12]研究發(fā)現(xiàn)長期跑臺運動可以抑制腓腸肌內(nèi)MSTN表達，但并不能改變比目魚肌內(nèi)MSTN表達水平.但是目前國內(nèi)關(guān)于急性抗阻運動對骨骼肌內(nèi)MSTN表達影響的研究較少見，本實驗彌補了國內(nèi)該方面研究的不足.此外，Haddad等[13]研究發(fā)現(xiàn)抗阻運動可以顯著抑制骨骼肌內(nèi)MSTN的表達，與本研究所得結(jié)果一致，但是Haddad采用了電刺激促使肌肉抗阻收縮的方式作為抗阻運動模型，而本研究采用的是負(fù)重爬梯訓(xùn)練.在C2C12細胞內(nèi)加入MSTN可以抑制Mighty啟動子活性，再向培養(yǎng)液中添加MSTN拮抗劑后Mighty啟動子活性逐漸恢復(fù)，提示MSTN在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控Mighty基因表達.MSTN先與活化素受體蛋白ⅡB(ActRⅡB)結(jié)合，增加Smad2/3介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，實現(xiàn)其功能.本研究發(fā)現(xiàn)急性抗阻運動后24 h內(nèi)MSTN mRNA的動態(tài)變化恰好與Mighty mRNA變化相反，提示急性抗阻運動通過抑制MSTN表達來增加Mighty基因的轉(zhuǎn)錄.

有研究發(fā)現(xiàn)Notch信號通路可抑制骨骼肌細胞內(nèi)的TGF-β信號通路，促進骨骼肌肥大.在衰老過程中TGF-β信號通路和Notch信號通路平衡被破壞，抑制了骨骼肌的重塑[14].誘導(dǎo)睪酮素水平增加不僅可以激活Notch信號通路、抑制TGF-β通路[15]，也可以激活肌衛(wèi)星細胞，促進骨骼肌肥大[16].而且MSTN是TGF-β家族成員之一，提示MSTN信號通路和Notch信號通路相互作用，共同調(diào)控骨骼肌質(zhì)量.本研究發(fā)現(xiàn)急性抗阻運動后即刻NICD蛋白表達顯著上調(diào)，并持續(xù)到運動后6 h，NICD是由Notch受體和Notch配體結(jié)合后經(jīng)由α分泌酶和γ分泌酶酶切產(chǎn)生的，是Notch信號通路的標(biāo)記性蛋白，提示急性抗阻運動后即刻Notch信號通路即被激活.本研究還發(fā)現(xiàn)MSTN在運動后6 h表達顯著性下調(diào)，Mighty基因在運動后6 h顯著性上調(diào)，說明MSTN信號通路變化是在Notch信號通路被激活之后產(chǎn)生的.Mighty基因是MSTN通路下游直接轉(zhuǎn)錄因子，提示急性抗阻運動可能通過激活Notch信號通路增加了Mighty基因的轉(zhuǎn)錄.

4 結(jié)論

急性抗阻運動可以抑制MSTN通路表達，增加Mighty基因的轉(zhuǎn)錄，其分子機制可能與急性抗阻運動后Notch信號通路的激活有關(guān).