5-氨基酮戊酸光動(dòng)力抗感染化學(xué)療法對(duì)中型無(wú)綠藻抑制作用的體外研究

劉澤虎 鐘燕 智慧林 桑波 李秋萍 呂聞聞 夏修蛟 沈宏

光動(dòng)力治療最初用于腫瘤治療[1]。目前光動(dòng)力抗感染化學(xué)療法越來(lái)越多被應(yīng)用于對(duì)抗生素耐藥的細(xì)菌、病毒、原蟲及致病性真菌感染[2]。近期國(guó)內(nèi)外研究表明，光動(dòng)力抗感染化學(xué)療法在許多難治性或復(fù)發(fā)性的皮膚淺表及皮下深部真菌感染中取得了良好療效。中型無(wú)綠藻是導(dǎo)致無(wú)綠藻病的主要病原菌，而目前治療無(wú)綠藻病的主流方法依然是使用抗真菌藥物，但是治療難度非常大[3]。鑒于5-氨基酮戊酸光動(dòng)力治療已取得美國(guó)食品藥品管理局和中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理總局的批準(zhǔn)，目前已廣泛應(yīng)用于臨床，因此筆者嘗試探討該療法體外對(duì)中型無(wú)綠藻是否具有抑制作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 菌株收集及鑒定 共收集7株中型無(wú)綠藻（CMCCC O22a、O22b、O22c、O22d、O22e、O22f、O22g），均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所中國(guó)醫(yī)學(xué)真菌保藏中心惠贈(zèng)。所有無(wú)綠藻菌株通過(guò)同化試驗(yàn)及26S rDNA D1/D2區(qū)序列測(cè)序鑒定到種[4]。

1.2 5-氨基酮戊酸配制 用雙蒸水避光條件下配制5-氨基酮戊酸溶液，濃度為50mmol/L。過(guò)濾去除細(xì)菌，4℃避光保存。

1.3 菌懸液制備 將菌株在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)種2次，以保證其純度和活力；經(jīng)37℃培養(yǎng)48h的菌落，用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液制成菌懸液；通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將菌懸液調(diào)制成（2～5）×105cfu/ml。

1.4 分組及光動(dòng)力治療 參照相關(guān)文獻(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組分為3組[5]：T1組為1mmol/L 5-氨基酮戊酸溶液與中型無(wú)綠藻37℃避光孵育30min，T2組為5mmol/L 5-氨基酮戊酸溶液與中型無(wú)綠藻37℃避光孵育30min，T3組為10mmol/L 5-氨基酮戊酸溶液與中型無(wú)綠藻37℃避光孵育30min，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組均接受激光照射。對(duì)照組分為3組：C1組為不加5-氨基酮戊酸溶液的中型無(wú)綠藻37℃避光孵育30min后不接受照射，C2組為加5-氨基酮戊酸溶液的中型無(wú)綠藻37℃避光孵育30min后不接受照射，C3組為不加5-氨基酮戊酸溶液的中型無(wú)綠藻37℃避光孵育30min后接受照射。菌懸液調(diào)制成約1×105cfu/ml，置于24孔板中。參照相關(guān)文獻(xiàn)，給予窄波LED（633±10）nm，LED-IB，武漢亞格光電技術(shù)有限公司），照射參數(shù)為100mW/cm2，距離為1cm，時(shí)間為20min[6]。

1.5 菌落計(jì)數(shù)法 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組經(jīng)上述處理后，每孔取10μl，用滅菌玻璃涂布棒均勻涂于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，37℃溫箱孵育，48～96h后待菌落形成明顯時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)。所有實(shí)驗(yàn)每組重復(fù)3孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Stata 14.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中型無(wú)綠藻3個(gè)對(duì)照組菌落計(jì)數(shù)比較 7株中型無(wú)綠藻3個(gè)對(duì)照組菌落計(jì)數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；經(jīng)兩兩比較，C2組菌落計(jì)數(shù)均明顯低于C1組、C3組（均P＜0.05）；提示C2組單純使用5-氨基酮戊酸溶液且不照光的情況下，依然能在一定程度上抑制中型無(wú)綠藻的生長(zhǎng)，見表1。

表1 中型無(wú)綠藻3個(gè)對(duì)照組菌落計(jì)數(shù)比較（×103cfu/ml）

2.2 中型無(wú)綠藻3個(gè)實(shí)驗(yàn)組菌落計(jì)數(shù)比較 3個(gè)實(shí)驗(yàn)組每株中型無(wú)綠藻生長(zhǎng)均受到抑制，與C2組菌落計(jì)數(shù)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。僅有3株中型無(wú)綠藻（O22a、O22c、O22d）3個(gè)實(shí)驗(yàn)組菌落計(jì)數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；另4株中型無(wú)綠藻（O22b、O22e、O22f、O22g）3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組菌落計(jì)數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。參考國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)，筆者以C1組為參照，計(jì)算不同濃度5-氨基酮戊酸光動(dòng)力處理后中型無(wú)綠藻菌生長(zhǎng)總的受抑制率，結(jié)果為41.78%～87.82%，平均為（66.81±10.94）%。將5-氨基酮戊酸光動(dòng)力處理后7株中型無(wú)綠藻生長(zhǎng)總的受抑制率合并后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，T1、T2和T3組中型無(wú)綠藻菌生長(zhǎng)總的受抑制率分別為（59.09±10.27）%、（70.44±11.01）%和（70.90±7.12）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.17，P＜0.05）；經(jīng)兩兩比較，T2、T3組中型無(wú)綠藻生長(zhǎng)受抑制率均明顯高于T1組（均P＜0.05），T2與T3組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 不同5-氨基酮戊酸濃度光動(dòng)力處理后中型無(wú)綠藻菌落計(jì)數(shù)的比較（×103cfu/ml）

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于無(wú)綠藻病尤其是皮膚無(wú)綠藻病的報(bào)道逐漸增多[7-13]。雖然無(wú)綠藻病尚無(wú)公認(rèn)有效的治療方案，但主流方案依然是使用抗真菌藥物。臨床上無(wú)綠藻病治療失敗的現(xiàn)象很常見[3]。光動(dòng)力抗感染化學(xué)療法已被成功用于各種致病性真菌感染、難治性或復(fù)發(fā)性皮膚及皮下深部的真菌感染[5-6，14-15]。

筆者通過(guò)體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5-氨基酮戊酸光動(dòng)力抗感染化學(xué)療法能抑制中型無(wú)綠藻的生長(zhǎng)，而單純加5-氨基酮戊酸但不接受照射的C2組中型無(wú)綠藻的生長(zhǎng)亦能被抑制，與國(guó)外關(guān)于致病真菌的研究結(jié)果一致[14]；筆者推測(cè)可能機(jī)制是5-氨基酮戊酸的酸性環(huán)境能抑制真菌及無(wú)綠藻的生長(zhǎng)。與C2組比較，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中型無(wú)綠藻的生長(zhǎng)均受到明顯抑制，進(jìn)一步證實(shí)5-氨基酮戊酸光動(dòng)力治療能抑制中型無(wú)綠藻的生長(zhǎng)。以C1組為參照，經(jīng)5-氨基酮戊酸光動(dòng)力處理后中型無(wú)綠藻生長(zhǎng)總的受抑制率為41.78%～87.82%，與國(guó)外臨床資料顯示的光動(dòng)力治療對(duì)致病真菌的50%～80%或更高的抑制率類似[16]。本研究結(jié)果顯示，5-氨基酮戊酸濃度為1～5mmol/L時(shí)，光動(dòng)力治療抑制中型無(wú)綠藻的效應(yīng)具有濃度依賴性，但超過(guò)5mmol/L后這一效應(yīng)并不增強(qiáng)。以上體外研究結(jié)果均表明了5-氨基酮戊酸光動(dòng)力治療無(wú)綠藻病尤其是皮膚無(wú)綠藻病的可能性。最近有西班牙學(xué)者通過(guò)溫?zé)岑煼?lián)合抗真菌藥物成功治療無(wú)綠藻病[17]。相關(guān)研究表明光動(dòng)力治療不僅能直接抑制靶細(xì)胞的生長(zhǎng)，還具有溫?zé)嵝?yīng)，進(jìn)一步加強(qiáng)細(xì)胞毒性反應(yīng)[18]。近期亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)光動(dòng)力治療能提高抗真菌藥物的敏感性[11]，亦有研究發(fā)現(xiàn)光動(dòng)力治療與氟康唑聯(lián)合使用能產(chǎn)生協(xié)同作用[19]，進(jìn)一步表明了5-氨基酮戊酸光動(dòng)力抗感染化學(xué)療法輔助抗真菌藥物用于臨床皮膚無(wú)綠藻病的前景。

5-氨基酮戊酸光動(dòng)力抗感染化學(xué)療法抑制真菌的機(jī)制可能是5-氨基酮戊酸作為前體藥物，在真核細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為原卟啉IX，在相應(yīng)波長(zhǎng)的光線照射下原卟啉IX產(chǎn)生單線態(tài)氧及其他自由基，從而殺傷真菌細(xì)胞。但這一療法對(duì)中型無(wú)綠藻的具體抑菌機(jī)制及作用的靶細(xì)胞器有待進(jìn)一步研究，對(duì)皮膚無(wú)綠藻病的有效性也有待進(jìn)一步臨床驗(yàn)證。