1 株水開菲爾粒中植物乳桿菌的鑒定及產(chǎn)細(xì)菌素基因分析

梁新紅，冉軍艦,*，孫華迪，趙瑞香，焦凌霞，盧艷清

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，新鄉(xiāng)市農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南科技學(xué)院新科學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

食品安全是影響食品質(zhì)量的重要方面，其中食源性微生物引發(fā)的疾病在發(fā)達(dá)和發(fā)展中國家均廣泛存在，嚴(yán)重威脅公共健康。經(jīng)過多年研究，與危害人類健康相關(guān)的食品病原微生物已經(jīng)得到鑒定，比如腸炎沙門菌（Salmonella enteritidis）和大腸桿菌（Eschericia coli），這兩種菌引起75%的食源性疾病[1]。通過抗生素可以抑制病原菌的生長，但是抗生素的濫用使病原菌產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重威脅人類的健康，所以天然抑菌物質(zhì)得到越來越多的重視。細(xì)菌素是由乳酸菌產(chǎn)生的具有抑菌活性肽類或蛋白類物質(zhì)，可用于食品的防腐。產(chǎn)生細(xì)菌素的菌種來源于食品、動物、植物和臨床樣品[2-8]，而且不同的菌種產(chǎn)生的細(xì)菌素種類不盡相同，如Nisin（Lactococcus sp.）、Pediocin（Pediococcus sp.）、Lactocin（Lactobacillus sp.）、Enterocin（Enterococcus sp.），革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌產(chǎn)生更多種類的細(xì)菌素[9-12]。細(xì)菌素因具有獨(dú)特的抑菌機(jī)制且無毒、無殘留、無抗藥性的特點(diǎn)受到了越來越多的關(guān)注。目前已有多種細(xì)菌素已經(jīng)被分離鑒定，比如Subtilin、Cerein、Thuricin、Plantaricin[13]。但是到目前為止只有Nisin（Lactococcus lactis）、Pediocin（Pediococcus acidilactici）等少量的細(xì)菌素作為商業(yè)生產(chǎn)，其他細(xì)菌素仍處于實(shí)驗(yàn)階段，所以細(xì)菌素作為添加劑或者化學(xué)抗菌劑的替代品具有很大潛力，可以廣泛的應(yīng)用在食品行業(yè)。水開菲爾是一種自然發(fā)酵的飲料，具有改善人體胃腸道蠕動、增強(qiáng)身體免疫力的作用，在全球范圍廣泛飲用[14-18]。將水果、水、糖和開菲爾粒混合無氧發(fā)酵2～4 d即可獲得水開菲爾[19-20]，在發(fā)酵后期，水開菲爾粒在水開菲爾中形成，通過過濾將水開菲爾粒分離重復(fù)利用。水開菲爾粒易碎，由胞外多糖組成，并含有多種微生物[21-23]。近些年來，有研究關(guān)注于水開菲爾粒發(fā)酵過程的微生物菌落動力學(xué)、生物多樣性和代謝組學(xué)，通過研究證明在水開菲爾發(fā)酵過程中起主要作用的是乳酸菌，如副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、希氏乳桿菌（L.hilgardii）和植物乳桿菌（L. plantarum），以及酵母，如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等[24]。

本研究從水開菲爾粒中分離出1 株具有抑菌活性的菌株，以該菌為研究對象，對該菌株所屬菌種、所產(chǎn)細(xì)菌素相關(guān)基因進(jìn)行鑒定，并對其編碼基因進(jìn)行分析。研究結(jié)果為該菌株和其細(xì)菌素的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株QF01從水開菲爾分離并于實(shí)驗(yàn)室保藏；大腸桿菌（Escherichia coli JM109）為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸氫二銨2 g、Mg2SO4·7H2O 0.58 g、K2HPO42 g、硫酸錳0.25 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、吐溫80 1 mL、蒸餾水1 000 mL，微調(diào)pH 6.5；MRS固體培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基加瓊脂15 g/L，用于QF01菌的培養(yǎng)。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母浸膏5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0；LB固體培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基加瓊脂15 g/L，用于E. coli JM109的培養(yǎng)及乳酸菌細(xì)菌素活性測定。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-211C恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；JB-CJ-800超凈臺 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；JY600電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；GelX1650凝膠成像分析系統(tǒng) 上海歐翔科學(xué)儀器有限公司；Labcycler Standard Plus聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

在超凈工作臺中活化低溫保藏的菌種QF01，將菌種劃線于MRS固體培養(yǎng)基，在37 ℃條件下培養(yǎng)過夜，挑平板上的單菌落置于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng)12 h。

1.3.2 抑菌活性測定

采用牛津杯法測定：取指示菌液100 μL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，放置牛津杯，在杯中注入細(xì)菌素樣品50 μL，菌株QF01產(chǎn)生的細(xì)菌素由硫酸銨沉淀法獲得[25]。在4 ℃條件下靜置過夜，待細(xì)菌素充分?jǐn)U散后放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16 h，觀察抑菌圈大小，以磷酸緩沖液（pH 6.8）為對照每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)

各細(xì)菌素基因PCR合成引物參考文獻(xiàn)[26]，擴(kuò)增的各基因引物序列如表1所示，設(shè)計(jì)的引物在上海生工生物工程有限公司合成。

表1 11 對引物序列Table 1 Sequences of 11 pairs of primers used for PCR

1.3.4 PCR擴(kuò)增

用菌株QF01的DNA作為PCR的模板，對細(xì)菌素相關(guān)基因進(jìn)行PCR檢測。反應(yīng)體系為25 μL，包括DNA模板1 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTP 2 μL，Mg2+1.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，rTaq 0.125 μL，ddH2O 16 μL。細(xì)菌素相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)熱溫度95 ℃，時(shí)間5 min；解鏈溫度95 ℃、時(shí)間30 s，退火溫度53 ℃、時(shí)間30 s，延伸溫度72 ℃、時(shí)間90 s，循環(huán)30 次；溫度72 ℃再延伸5 min。擴(kuò)增結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠、1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳，在130 V電壓下，電泳30 min后，取出膠在EB染色池中染色15 min，然后通過紫外凝膠熒光掃描儀檢測。將PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD-19T克隆載體上，轉(zhuǎn)入E. coli DH-5α感受態(tài)細(xì)胞。在氨芐抗生素的LB平板上涂布培養(yǎng)，挑單菌落PCR鑒定，將獲得的陽性克隆送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.3.5 序列分析

利用NCBI網(wǎng)站BLAST程序?qū)Ξa(chǎn)物序列進(jìn)行同源性搜索，分析其保守序列并利用MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；使用ProParam tool（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）對其基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)進(jìn)行分析；利用TMHMM 2.0在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對QF01細(xì)菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列進(jìn)行跨膜螺旋信號分析；利用在線軟件（http://www.ebi.ac.uk）中的InterProScan工具對QF01細(xì)菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列結(jié)構(gòu)域預(yù)測；利用在線軟件（http://npsa-pbil.ibcp.fr/）中的SOPM工具進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；通過ExPASy（http://ca.expasy.org/）提供的SWISS-MODEL在線工具對蛋白質(zhì)進(jìn)行同源建模，查看空間模型[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性

菌株QF01發(fā)酵上清液中的細(xì)菌素作用于大腸桿菌，如圖1所示，通過與對照組相比較，發(fā)酵上清液具有抑菌作用。

圖1 菌株QF01產(chǎn)細(xì)菌素抑制大腸桿菌效果Fig. 1 Inhibitory effect of bacteriocin produced by strain QF01 against E. coli

2.2 菌株QF01基因組DNA提取分析與菌種鑒定

提取菌株QF01總DNA通過瓊脂糖凝膠電泳，提取的QF01總DNA條帶清晰，沒有雜條帶，片段大小在20 000 bp左右，以此基因組DNA作為16S rDNA的PCR擴(kuò)增模板，得到菌株QF01的16S rDNA片段。

圖2 菌株QF01 16S rDNA PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification product of 16S rDNA from strain QF01

如圖2所示，16S rDNA引物擴(kuò)增后的條帶在1 400 bp左右，將PCR產(chǎn)物送往測序公司進(jìn)行測序。測定的菌株QF01的16S rDNA序列結(jié)果提交至NCBI中的BLAST進(jìn)行對比，選取部分乳桿菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rDNA序列共8 個(gè)，用軟件MEGA 5.1構(gòu)建菌種系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖3可看出，該菌與L. planrarum strain Z55同源性最高，可初步確定該菌株為植物乳桿菌。

圖3 菌株QF01 16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain QF01 based on 16S rDNA sequence

2.3 細(xì)菌素合成基因鑒定

利用設(shè)計(jì)的11 對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖4。通過觀察，發(fā)現(xiàn)只有plnD、plnEF、plnR、plnV擴(kuò)增出現(xiàn)產(chǎn)物條帶，將PCR產(chǎn)物回收測序，進(jìn)行DNA序列的生物信息學(xué)分析。其他基因沒有擴(kuò)增出條帶，可能是因?yàn)樵摼缓羞@些細(xì)菌素的基因。

圖4 L. planrarum QF01細(xì)菌素相關(guān)基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of the bacteriocin-related genes of L. planrarum QF01

2.4 氨基酸序列比對分析

利用NCBI網(wǎng)站中的BLAST對植物乳桿菌QF01細(xì)菌素合成基因（plnD、plnEF、plnR、plnV）進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)PlnD、plnEF、plnR、plnV與植物乳桿菌相關(guān)基因核苷酸序列一致性達(dá)到96%～100%，這表明植物乳桿菌中plnD、plnEF、plnR、plnV基因的核苷酸序列有高度保守性。采用鄰位相接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示，圖中數(shù)字為Bootstrap 1 000 次的置信度，4 個(gè)pln系列基因在各自的發(fā)育樹中均與植物乳桿菌聚類，表明4 個(gè)基因的氨基酸序列在相同物種親緣關(guān)系較近，存在著共同進(jìn)化模式，可為乳桿菌各物種的分類提供依據(jù)。

圖5 植物乳桿菌QF01四種細(xì)菌素基因氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of four bacteriocin genes of L. plantarum QF01

2.5 相關(guān)基因編碼產(chǎn)物理化性質(zhì)分析

在線軟件蛋白預(yù)測結(jié)果顯示，plnD基因的編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為23 743.20 ku，氨基酸數(shù)為206，理論pI值為5.17，脂肪族氨基酸指數(shù)101.80，總平均親水性-0.270，不穩(wěn)定系數(shù)28.50，根據(jù)不穩(wěn)定系數(shù)大于40則該蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)[28]，說明該蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的。plnEF基因的編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為6 960.90 ku，氨基酸數(shù)為63，理論pI值為9.99，脂肪族氨基酸指數(shù)85.08，總平均親水性-0.192，不穩(wěn)定系數(shù)15.82，說明該蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的。plnR基因的編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為3 288.62 ku，氨基酸數(shù)為234，理論pI值為5.75，脂肪族氨基酸指數(shù)56.15，總平均親水性-0.692，不穩(wěn)定系數(shù)49.76，說明該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。plnV基因的編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為25 022.97 ku，氨基酸數(shù)為226，理論pI值為9.65，脂肪族氨基酸指數(shù)132.29，總平均親水性0.951，不穩(wěn)定系數(shù)20.88，說明該蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的。上述分析是軟件預(yù)測結(jié)果，需要進(jìn)一步表達(dá)純化出細(xì)菌素進(jìn)行驗(yàn)證。

2.6 跨膜螺旋信號分析

由表2可知，只有plnV基因編碼產(chǎn)物的跨膜螺旋中的氨基酸殘基數(shù)大于18[29]，前60 個(gè)氨基酸跨膜螺旋中的殘基數(shù)44 個(gè)（圖6），說明plnV基因編碼產(chǎn)物可能存在跨膜序列，且蛋白的N端存在信號肽。在PDB（Protein Data Bank）數(shù)據(jù)庫中只有1%左右的跨膜蛋白結(jié)構(gòu)[30]，膜蛋白在細(xì)胞和外界環(huán)境、細(xì)胞與細(xì)胞之間的信息識別、物質(zhì)交流及運(yùn)轉(zhuǎn)中起著不可替代的作用，所以plnV基因在細(xì)菌素合成過程中起著非常重要的作用，可深入研究。plnD、plnEF和plnR基因編碼產(chǎn)物均無跨膜區(qū)域和信號肽，說明這3 種基因編碼產(chǎn)物合成后不進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，保留在細(xì)胞基質(zhì)，易于提取分離。

表2 L. planrarum QF01細(xì)菌素相關(guān)基因編碼產(chǎn)物的氨基酸跨膜螺旋數(shù)據(jù)Table 2 Analysis of amino acid trans- membrane helix of products encoded by bacteriocin genes in L. planrarum QF01

圖6 plnV基因編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)序列跨膜螺旋預(yù)測分析Fig. 6 Prediction of the transmembrane helixes of plnV encoding product

2.7 結(jié)構(gòu)域分析

通過在線軟件分析可知，在plnD基因編碼產(chǎn)物序列中有信號傳導(dǎo)響應(yīng)調(diào)節(jié)接收器特征結(jié)構(gòu)域，位于第2～129個(gè)氨基酸之間（圖7），該結(jié)構(gòu)域是群體效應(yīng)中調(diào)控細(xì)菌素合成的反應(yīng)調(diào)節(jié)器特征結(jié)構(gòu)，對調(diào)節(jié)基因啟動子有重要的作用；在plnEF、plnR、plnV基因編碼產(chǎn)物序列中均沒有家族結(jié)構(gòu)特征。

圖7 L. plantarum QF01 plnD編碼產(chǎn)物預(yù)測結(jié)構(gòu)域Fig. 7 Predicted domain of plnD-encoding product

2.8 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析

表3 L. plantarum QF01細(xì)菌素合成相關(guān)基因編碼產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)分析Table 3 Analysis of secondary structures of proteins encoded by the bacteriocin-related genesof L. plantarum QF01

如表3所示，plnD、plnEF、plnR和plnV基因的編碼產(chǎn)物中均存在α-螺旋、伸展鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，其中α-螺旋在4 種基因編碼產(chǎn)物中所占比例最高。plnD基因編碼產(chǎn)物中有85 個(gè)氨基酸形成α-螺旋，占所有氨基酸的41.26%，plnEF基因編碼產(chǎn)物中有29 個(gè)氨基酸形成α-螺旋，占所有氨基酸的49.15%，plnR基因編碼產(chǎn)物中有101 個(gè)氨基酸形成α-螺旋，占所有氨基酸的43.16%，plnV基因編碼產(chǎn)物中有114 個(gè)氨基酸形成α-螺旋，占所有氨基酸的50.44%。

將4 種氨基酸序列進(jìn)行同源建模，結(jié)果如圖8所示。plnD編碼產(chǎn)物模型與DNA結(jié)合的反應(yīng)調(diào)節(jié)器蛋白模型同源性最高（22.5%），該蛋白是細(xì)菌素合成的調(diào)節(jié)因子；plnEF編碼產(chǎn)物模型與細(xì)菌素PlnF蛋白模型同源性為100%，plnE起到調(diào)控乳酸菌產(chǎn)生細(xì)菌素的作用；plnR編碼產(chǎn)物模型與甲酸通道蛋白模型同源性為10.89%；plnV編碼產(chǎn)物模型與Ras轉(zhuǎn)化酶1蛋白模型同源性為22.73%，該蛋白是一種膜內(nèi)蛋白酶，能阻斷Ras通路傳導(dǎo)信號。其中plnEF編碼產(chǎn)物同源性最高，另外3 種模型同源性較低。在圖8中能明顯看出蛋白二級結(jié)構(gòu)α-螺旋所占比例較大，對比空間結(jié)構(gòu)的元件及分布，證明二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)結(jié)果一致，表明模型的可信度較高。

圖8 L. plantarum QF01相關(guān)基因編碼產(chǎn)物的三級結(jié)構(gòu)Fig. 8 Tertiary structures of proteins encoded by the bacteriocinrelated genes of L. plantarum QF01

3 結(jié) 論

本研究從水開菲爾粒中分離鑒定出1 株具有抑菌效果的植物乳桿菌QF01，利用已報(bào)道細(xì)菌素相關(guān)基因的11 對特異性引物對植物乳桿菌QF01全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序，發(fā)現(xiàn)該菌基因組中存在plnD、plnEF、plnR和plnV基因，并獲得了4 種細(xì)菌素基因序列，通過生物信息學(xué)分析得知4 種細(xì)菌素氨基酸序列，確定plnR基因編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，plnD、plnEF和plnV基因編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定?？缒ぢ菪盘柗治龅弥猵lnV基因編碼產(chǎn)物可能存在跨膜序列，且蛋白的N端可能存在信號肽，由于跨膜蛋白在生命體內(nèi)有著重要的作用，所以plnV基因編碼產(chǎn)物可進(jìn)行深入研究。因此，本研究利用分子技術(shù)鑒定細(xì)菌素的方法可以為食品安全提供材料，而且為細(xì)菌素外源表達(dá)提供理論支持。