譚 霄，孫 擎，曾 林，趙婷婷，譚金龍，張 慶,*，向文良

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610039；2.西華大學(xué)古法發(fā)酵（釀造）生物技術(shù)研究所，四川 成都 610039）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是廣泛存在于植物、動物和微生物中的一種非蛋白質(zhì)氨基酸[1]。在哺乳動物腦組織中，GABA是一種重要的抑制性遞質(zhì)，具有降血壓、鎮(zhèn)靜神經(jīng)、利尿、改善腦機(jī)能、增進(jìn)腦活力等功能[2-3]。此外，GABA還具有抗熱應(yīng)激和提高飼料的利用率等作用[4]。因此GABA被廣泛應(yīng)用到食品、醫(yī)藥、保健品及農(nóng)業(yè)等行業(yè)[5]。目前，合成GABA主要有化學(xué)合成法、植物富集法和微生物合成法，相比而言，微生物合成法具有條件溫和、安全性好、耗能低等優(yōu)點(diǎn)[6-10]，因此，近年來微生物合成法制備GABA受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注，其中對紅曲霉、釀酒酵母、乳酸菌等[11]研究較為深入，特別是具有保健作用的乳酸菌用于合成GABA受到人們的青睞。

乳酸菌合成GABA是通過谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）專一性、不可逆地催化L-谷氨酸或鈉鹽α-脫羧而成[12]。GAD在野生乳酸菌中受到菌體自身代謝水平的控制，導(dǎo)致GAD的表達(dá)量不高[13]。同時(shí)，乳酸菌是兼性厭氧微生物，發(fā)酵周期較長，培養(yǎng)條件較難控制，而大腸桿菌（Escherichia coli）生長迅速、易于高密度發(fā)酵，易借助基因工程手段實(shí)現(xiàn)GABA的高效率生產(chǎn)[14-16]。目前，Park[17]、李杰[18]及Somasundaram[19]等分別將短桿菌、釀酒酵母、嗜熱古菌的GAD轉(zhuǎn)入到E. coli BL21（DE3）實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)；Mazzoli等[20]研究了短桿菌發(fā)酵產(chǎn)GABA轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的相互關(guān)系；李理等[21]研究植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）發(fā)酵不同時(shí)間點(diǎn)GABA產(chǎn)量和GAD相對表達(dá)量之間的關(guān)系；齊育平等[22]對短乳桿菌GAD的基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。而對L. plantarum GAD進(jìn)行原核表達(dá)，并對基因工程菌的GAD相對表達(dá)量和GABA產(chǎn)量相互關(guān)系的探討及生物信息學(xué)的綜合分析鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以1 株從四川泡菜中篩選的產(chǎn)GABA的L. plantarum BC114[3]為出發(fā)菌株，通過克隆其GAD基因gad，生物信息學(xué)分析，并將gad轉(zhuǎn)入E. coli BL21（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)對gad表達(dá)量、蛋白表達(dá)量和GABA產(chǎn)量進(jìn)行評估，探究gad在轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)上的相互關(guān)聯(lián)，為gad改造和發(fā)酵提高GABA產(chǎn)量提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

E. coli BL21（DE3）、E. coli JM109、pGEM-T Simple Vector 普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；L. plantarum BC114、pET-28a（＋）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI 美國Thermo公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒、細(xì)菌總RNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司；T4 DNA連接酶、Pfu DNA聚合酶 Promega（北京）生物技術(shù)有限公司；RT EasyTMI（For first-strand cDNA synthesis）試劑盒 福際生物技術(shù)（成都）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Biometra聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、qTOWER2 2.2熒光定量PCR德國耶拿分析儀器有限公司；2695高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配有Waters2998紫外檢測器） 美國Waters公司；凝膠成像系統(tǒng)、DYCP-31瓊脂糖水平電泳系統(tǒng)、垂直電泳系統(tǒng)美國Bio-Rad公司；BHC-1300A2冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 gad的克隆及測序

將L. plantarum BC114在MRS液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，利用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取其基因組DNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增gad基因，引物[23]見表1，下劃線為EcoRI和BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。PCR體系（50 μL）：40.5 μL ddH2O，5 μL 10×Buffer with MgSO4，1 μL dNTP（10 mmol/L），1 μL upstream primer（20 μmol/L），1 μL downstream primer（20 μmol/L），0.5 μL Pfu DNA Polymerase，1 μL DNA template（100 ng/μL）；反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30 次，最后72 ℃ 10 min。

表1 克隆目的基因gad和熒光定量PCR引物Table 1 Primers used for cloning of target genes and real-time PCR

以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物是否正確，并進(jìn)行膠回收。目的片段與pGEM-T載體通過T4 DNA連接酶，25 ℃過夜連接，熱激轉(zhuǎn)入E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中。在含100 μg/mL氨芐青霉素（ampicillin，Amp）平板上培養(yǎng)過夜，挑取單克隆在含100 μg/mL Amp液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～10 h，抽提質(zhì)粒得到pGEM-T-gad，并采用酶切電泳和測序鑒定，序列測定由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。

1.3.2 GAD的生物信息學(xué)分析

使用ExPASY的Protparam工具對gad編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測和分析；應(yīng)用TMHMM Server v. 2.0在線工具預(yù)測基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，同時(shí)，利用PSIPED V3.3在線分析工具分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹；應(yīng)用Swiss-Model在線工具進(jìn)行同源建模，并用PROCHECK軟件進(jìn)行模型評估。

1.3.3 重組菌的構(gòu)建

將克隆載體pGEM-T-gad經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖核酸電泳，膠回收獲得目的片段，并連接至同樣經(jīng)過EcoRI和BamHI雙酶切的表達(dá)載體pET-28a（＋），熱激轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞E. coli BL21（DE3）中，經(jīng)菌落和酶切鑒定，獲得E. coli BL21（DE3）/pET-28a-gad。

1.3.4 重組蛋白在E. coli BL21（DE3）中的誘導(dǎo)表達(dá)

將E. coli BL21（DE3）/pET-28a-gad轉(zhuǎn)入到卡那平板上，通過菌落PCR篩選出陽性克隆子，并將其接種至含50 μg/mL卡那霉素的10 mL LB培養(yǎng)基中37 ℃、150 r/min活化8～10 h，以2%接種量轉(zhuǎn)到含50 mg/L卡那霉素的100 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)到OD600nm為0.6后加入1 mmol/L IPTG和0.05 mmol/L磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP），降溫至28 ℃，180 r/min進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，在誘導(dǎo)期間取2、4、6、8、10 h的發(fā)酵液于后續(xù)分析。

1.3.5 基因表達(dá)水平的測定

1.3.5.1 重組菌發(fā)酵過程中g(shù)ad相對表達(dá)量的測定

取不同時(shí)間菌液，并按RNA提取試劑盒（天根）操作說明書步驟進(jìn)行，并加入DNaseI酶（37 ℃，15 min；65 ℃，10 min）以去除RNA樣品中殘留的基因組DNA。按照試劑盒說明書（福際）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA第1鏈。以反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。利用軟件Primer 5.0對目的基因core of gad和內(nèi)參基因16S rRNA設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。

PCR體系（20 μL）：熒光混合染料10 μL、正反向引物各0.4 μL、cDNA模板0.5 μL，加無菌雙蒸水至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，循環(huán)40 次；溶解曲線分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s。

基因表達(dá)量的定量以16S rRNA為內(nèi)參基因，發(fā)酵時(shí)間10 h的gad表達(dá)量為參比樣本，以無菌雙蒸水代替cDNA模板作為陽性對照，分析各基因Ct值（每個(gè)樣品設(shè)置3次平行實(shí)驗(yàn)）。利用2-ΔΔCt法對GAD表達(dá)量進(jìn)行相對定量（其中，Ct是擴(kuò)增基因達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)，ΔCt是目的基因與內(nèi)參基因Ct值的差值，ΔΔCt是實(shí)驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)間點(diǎn)ΔCt值的差值）[24]。

1.3.5.2 重組菌發(fā)酵過程中十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

將菌液離心收集菌體，并用生理鹽水進(jìn)行洗滌，加入2×樣品緩沖液煮沸10 min，然后13 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行10%的SDS-PAGE分析。

1.3.5.3 重組菌產(chǎn)GABA表達(dá)能力評估

根據(jù)陳琳等[11]報(bào)道，以5 mL質(zhì)量濃度為5 g/L的L-谷氨酸鈉為底物，以不同發(fā)酵時(shí)間的菌體4 mg，乙酸-乙酸鈉緩沖液（含2.5 mmol/L Ca2＋、3.5 mmol/L Mg2＋）調(diào)pH值為4.5，45 ℃條件下反應(yīng)4 h。參照并結(jié)合Diana等[25]利用DNS-Cl衍生化的方法測定重組菌不同時(shí)間發(fā)酵液的GABA產(chǎn)量，HPLC分析條件：色譜柱為島津-GL INERTSIL ODS-3（4.6 mm×150 mm，5 μm）；紫外檢測波長254 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動相A為甲醇，流動相B為醋酸鈉（pH 6.2）-甲醇-四氫呋喃（84∶25∶1，V/V）；流速1 mL/min；梯度洗脫時(shí)，流動相B比例：0～6 min，維持80%；6～20 min，80%～20%；20～27 min，20%～0%；27～30 min，返回80%。

2 結(jié)果與分析

2.1 L. plantarum BC114中g(shù)ad的克隆

圖1 重組質(zhì)粒pGEM-T-gad的酶切結(jié)果Fig. 1 Identification of recombinant vector pGEM-T-gad by restriction enzyme digestion

以L. plantarum BC114基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到目的片段，膠回收該片段與pGEM-T Simple Vector連接，并轉(zhuǎn)入E.coli JM109，篩選陽性克隆子，重組質(zhì)粒酶切結(jié)果見圖1。由EcoRI酶切結(jié)果可知，酶切后得到2 條明顯分離的條帶，其中1 條在大約3 000 bp處，另1 條在大約1 400 bp處，片段大小與李杰[18]報(bào)道的一致，表明該菌株可能有g(shù)ad的存在，隨后測序并對序列進(jìn)行分析。

2.2 L. plantarum BC114中GAD的生物信息學(xué)分析

通過ExPASY的protparam在線工具結(jié)果表明：L. plantarum GAD蛋白由469 個(gè)氨基酸編碼而成（GenBank登錄號MF418590），其中帶正電荷氨基酸殘基（Arg＋Lys）共40 個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp＋Glu）總數(shù)為60 個(gè)，蛋白質(zhì)理論分子等電點(diǎn)為5.58，分子式為C2412H3652N648O693S2，脂溶性指數(shù)為84.65。GAD蛋白在溶液中不穩(wěn)定指數(shù)為30.53（＜40），說明該蛋白在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定?？寺〉腉AD所編碼的蛋白的二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲構(gòu)成，分別占32.2%、11.5%、56.3%。同時(shí)，采用TMHMM Server v. 2.0預(yù)測顯示，GAD蛋白中無跨膜結(jié)構(gòu)域，為非跨膜蛋白。

圖2 GAD氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic analysis of amino acid sequence of GAD

Grone等[26]分析了脊椎動物中3 種GAD的差異，并用氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析親緣關(guān)系，表明GAD3與GAD1和GAD2具有同源性，但是對于L. plantarum的GAD的親緣關(guān)系鮮見報(bào)道。本研究基于GAD氨基酸序列，采用鄰位相接法（Neighbor-Joining）對其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果見圖2。L. plantarum BC114的GAD聚類在同一類群，同時(shí)，短乳桿菌的GAD也聚為一類，而其他Enterococcus gallinarum和Lactococcus lactis不同屬的聚為一類，Lactobacillus spicheri和Lactobacillus senmaizukei不同種也聚為一類。因此，GAD在細(xì)菌中既有物種之內(nèi)的保守性，又有物種之間相對變異性，較真實(shí)地反映了不同物種間的自然演化過程[19]。

圖3 GAD的三級結(jié)構(gòu)（A）和拉氏構(gòu)象圖（B）Fig. 3 Predicted tertiary structure (A) and Ramachandran plot (B) of GAD

采用Swiss-Model在線預(yù)測工具進(jìn)行同源建模構(gòu)建未知蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，對于序列相似性大于30%的蛋白序列能夠建立準(zhǔn)確性較高的模型。對L. plantarum BC114的GAD進(jìn)行同源建模，選擇與PDB數(shù)據(jù)庫中GAD蛋白同源最高的蛋白E. coli gad（3fz6.1），相似度45.50%，模擬GAD蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3A所示，GAD的折疊方式符合二級結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果。

采用PROCHECK工具對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行評估，結(jié)果見圖3B。拉氏圖中的每個(gè)區(qū)域的顏色由深到淺排列的次序依次為最佳合理區(qū)、額外合理區(qū)、一般合理區(qū)以及不合理區(qū)。結(jié)果顯示，有85.9%處于最佳合理區(qū)，說明這些氨基酸殘基之間不存在重疊和不合理接觸，而額外合理區(qū)、一般不合理和不合理區(qū)分別占11.4%、2.2%、0.5%，此評估結(jié)果與郁凱[27]報(bào)道的大體一致。

2.3 重組表達(dá)載體pET-28a-gad的構(gòu)建

隨機(jī)挑取平板上菌落進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析在約1 400 bp出現(xiàn)條帶，與預(yù)期的條帶大小一致，結(jié)果見圖4A，挑取該菌落培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，進(jìn)行EcoRI和BamHI雙酶切，酶切結(jié)果見圖4B。在5 000 bp處為pET-28a（＋）質(zhì)粒（5 369 bp），1 400 bp左右為gad片段。表明目的基因已成功連接到載體上，隨后的測序結(jié)果準(zhǔn)確無誤，可用于后續(xù)的異源表達(dá)。

圖4 菌落PCR（A）和重組質(zhì)粒pET-28a-gad的雙酶切驗(yàn)證（B）Fig. 4 PCR analysis of positive monoclonal colonies (A) identification of recombinant vector pET-28a-gad by double restriction enzyme digestion (B)

2.4 gad表達(dá)水平的測定

2.4.1 重組菌gad相對表達(dá)量的測定結(jié)果

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)gad相對表達(dá)量Fig. 5 Relative expression levels of gad at different fermentation times

實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用熒光信號的強(qiáng)弱與擴(kuò)增物的量呈正比來實(shí)現(xiàn)定量，已廣泛應(yīng)用于基因突變檢測、微生物學(xué)檢測、基因表達(dá)的研究等領(lǐng)域[28-29]。圖5結(jié)果表明，在不同發(fā)酵時(shí)間均檢測到gad的mRNA，表明轉(zhuǎn)入的gad在轉(zhuǎn)錄水平上已表達(dá)。gad表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長大體呈先升高后降低的趨勢，與發(fā)酵相同時(shí)間點(diǎn)GABA產(chǎn)量趨勢總體上一致（圖5和圖8）。發(fā)酵2～4 h，GABA產(chǎn)量已有顯著增加，而此時(shí)的GAD基因gad相對表達(dá)量變化并不顯著；6 h相對表達(dá)量達(dá)到最高值，為10 h的4.23倍；8 h相對表達(dá)量較6 h有所降低，而GABA產(chǎn)量有所推遲并在8 h達(dá)到最大值。本實(shí)驗(yàn)與基因表達(dá)相比，相關(guān)產(chǎn)物的合成具有一定的滯后性，但又不是單純的滯后關(guān)系，Mazzoli等[20]報(bào)道GABA產(chǎn)量在基因或者轉(zhuǎn)錄水平上與GAD編碼基因的關(guān)系不是非常緊密，可能受到其他基因的調(diào)控。

2.4.2 重組菌GAD表達(dá)蛋白SDS-PAGE分析

圖6 pET-28a-gad表 達(dá)蛋白SDS-PAGE圖Fig. 6 SDS-PAGE analysis of expressed product from pET-28a-gad

將重組的pET-28a-gad轉(zhuǎn)入表達(dá)型E. coli BL21（DE3）加入IPTG和PLP進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)過垂直電泳并染色再脫色，結(jié)果見圖6。與E. coli BL21（DE3）相比，重組菌均在54 kDa附近出現(xiàn)特異性條帶，與Park等[17]報(bào)道的GAD大小一致。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，蛋白表達(dá)量相應(yīng)的增多，在誘導(dǎo)8 h時(shí)蛋白表達(dá)量達(dá)到最大，隨后有所減低。這與田靈芝[29]的研究結(jié)果相同，即用E. coli BL21（DE3）作為宿主細(xì)胞時(shí)，宿主菌本身的蛋白酶能降解異源蛋白，在誘導(dǎo)末期時(shí)較為明顯，因此最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為8 h。

2.4.3 重組菌產(chǎn)GABA表達(dá)能力評估

圖7 不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)GABA色譜圖Fig. 7 Chromatograms of GABA produced at different fermentation times

利用HPLC對不同誘導(dǎo)發(fā)酵時(shí)間重組菌產(chǎn)GABA能力進(jìn)行評估，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=106X-246 533（R2=0.999 9），可用于發(fā)酵液中GABA定量分析，結(jié)果見圖7、8。結(jié)果表明，重組菌產(chǎn)GABA的最大值為2 387 mg/L，相比原始菌株L. plantarum BC114 GABA產(chǎn)量1 720 mg/L[3]，提高了38.7%。GABA產(chǎn)量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長呈現(xiàn)增加趨勢，隨后有所降低，與對應(yīng)的發(fā)酵時(shí)間蛋白表達(dá)量趨勢變化一致。GABA產(chǎn)量在2～4 h顯著增加，而此刻對應(yīng)的蛋白量也增加，兩者都在發(fā)酵8 h達(dá)到最大值，在發(fā)酵合成GABA主要受到GAD的影響[30]，因此酶含量越高更利于將L-谷氨酸鈉轉(zhuǎn)化為GABA。隨著發(fā)酵時(shí)間的繼續(xù)延長酶含量有所降低，可能是因?yàn)镋. coli BL21（DE3）本身的蛋白酶能降解異源GAD從而導(dǎo)致GABA含量降低。

圖8 不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)GABA產(chǎn)量Fig. 8 GABA accumulation levels at different time points of fermentation

3 結(jié) 論

本研究利用前期實(shí)驗(yàn)室篩選的L. plantarum BC114 GAD進(jìn)行克隆，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，GAD核酸序列長度1 410 bp，編碼469 個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為5.58，蛋白的二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲構(gòu)成，分別占32.2%、11.5%、56.3%，實(shí)現(xiàn)酶蛋白三級結(jié)構(gòu)的建模預(yù)測；成功構(gòu)建了基因工程菌E.coli BL21（DE3）/pET-28a-gad，在IPTG和PLP的誘導(dǎo)下，該重組菌表達(dá)了一個(gè)特異性的分子質(zhì)量約為54 kDa的融合蛋白。重組菌生物合成GABA量最高達(dá)到2 387 mg/L，相比L. plantarum BC114提高了38.7%。GABA代謝物的生成與gad的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)不是同步進(jìn)行，而是具有一定滯后性。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步進(jìn)行GAD分子改造和提高GABA產(chǎn)量提高提供一定的理論依據(jù)。