葡萄糖苷酶制備冷水溶蘿卜花青素修飾物的工藝優(yōu)化和表征

江 文，周 楨，李曉輝，周小華,*，周志明，劉 兵

（1.重慶大學化學化工學院，重慶 401331；2.廣州六順生物科技有限公司，廣東 廣州 510032）

以蘿卜花青素為主要成分的蘿卜紅色素是從胭脂蘿卜（Raphanus sativus var. sativus）中提取出來的一種天然紅色素。蘿卜紅色素色澤鮮艷、口感良好，不同于人工合成色素，無毒副作用，是國家添加劑標準委員會允許使用的天然色素之一，廣泛應用于食品等領(lǐng)域[1-7]。目前，市售的蘿卜紅色素普遍存在冷水可溶性差和蘿卜異味強烈等缺點，尤其是其冷水可溶性差的缺點，使得其應用受限，成為阻礙該色素可持續(xù)發(fā)展的瓶頸[8]。蘿卜紅色素主要由天竺葵素-3-槐二糖苷、還原糖、果膠無機鹽和異硫氰酸酯等組成[9-10]，天竺葵素-3-槐二糖苷為類黃酮化合物，其母核中的C6—C3—C6結(jié)構(gòu)電子云共享，三環(huán)同平面，分子間通過疏水相互作用而排列緊密，使得其在冷水中的溶解性較低[11]，但是在熱水中，蘿卜花青素的溶解性較高，這是由于加熱會使得其分子間從原來有序的緊密結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o秩序的松散結(jié)構(gòu)，使得分子間的相互作用減弱[12-13]，從而溶解性提高，所以這也是蘿卜花青素在冷水中溶解度低的主要原因；此外，分子中的酚羥基、醇羥基參與形成的氫鍵，也可能影響到其溶解性。因此，削弱蘿卜紅色素分子間的疏水相互作用及氫鍵數(shù)量或強度均可提升蘿卜紅色素的溶解性。

削弱蘿卜紅色素分子間疏水相互作用的方法主要有化學修飾和酶法修飾[14-15]?；瘜W修飾如甲基化、磺化等，甲基化和磺化均因存在生成毒害物質(zhì)的副反應、試劑殘留以及污染的風險，受到嚴格限制。利用生物催化劑酶進行物質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾由于具有修飾條件溫和、專一性強及綠色環(huán)保等優(yōu)勢，受到廣泛關(guān)注[17]。對黃酮化合物的酶法修飾，主要研究集中在糖基轉(zhuǎn)移方面[16]，涉及的酶有兩類，一類是糖基轉(zhuǎn)移酶，另一類是糖苷酶[17]。前者催化從糖分子上切割糖基轉(zhuǎn)移到配體，形成糖苷鍵；后者從糖基上切割糖殘基，生成游離單糖或寡糖。鄭美瑜等[18]用橙皮苷酶和柚皮苷酶修飾橙皮苷和柚皮苷，改善了其水溶性和理化性質(zhì)。盛占武等[19]用環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶修飾橙皮苷，生成水溶性α-葡萄糖基橙皮苷。蘿卜紅色素系天竺葵素與槐二糖基形成的糖苷，但是，位于天竺葵素母核3-OH的槐二糖基由于單鍵自由旋轉(zhuǎn)及存在7 個游離羥基，極易形成分子內(nèi)和分子間氫鍵，有利于形成蘿卜紅色素分子間的疏水相互作用，降低水溶性；從理論上講，用糖苷酶精確切除其槐二糖基上的1 個游離葡萄糖殘基，可削弱修飾物天竺葵素-3-葡萄糖苷形成氫鍵的范圍和數(shù)量，進而改善其水溶性。目前，鮮見這方面的研究報道。

本實驗以市售蘿卜紅色素為原料，先進行分離純化，制備出純化蘿卜花青素，再用葡萄糖苷酶對其進行酶法修飾，獲得修飾物。探究修飾物的結(jié)構(gòu)，并用正交試驗法確定其最佳修飾條件，驗證其冷水溶解性、抗氧化能力以及對人肝癌細胞株MHCC97L的生長抑制作用。旨在提供一種制備冷水可溶性良好的功能性蘿卜紅色素衍生物的方法和產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘿卜花青素 重慶海巨農(nóng)業(yè)發(fā)展公司；葡萄糖苷酶（生物純，酶活力14 U/mg） 甘肅和氏璧生物有限公司；鄰二氮菲（分析純） 浙江省溫州東升化工試劑廠；青霉素、鏈霉素（均為生物純） 重慶西南藥業(yè)有限公司；3,5-二硝基水楊酸（分析純） 成都科龍化工試劑廠；葡萄糖（分析純） 重慶北碚化學試劑廠；原花青素B2（純度≥98%）由本實驗室自制；人肝癌細胞株MHCC97L 中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

90-2定時恒溫磁力攪拌器 上海滬西分析儀器有限公司；CS501-SP超級數(shù)顯恒溫器 重慶四達實驗儀器有限公司；101-1AB電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；FD-1真空冷凍干燥機 北京德天佑科技發(fā)展有限公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市億通電子有限公司；SY-CJ-1F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)公司；8000細胞培養(yǎng)箱 美國Thermo Fisher公司；6、96 孔板細胞培養(yǎng)板 美國Corning公司；LC3000高效液相色譜儀 北京創(chuàng)新通恒科技有限公司；TU1901紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；550紅外光譜儀 美國Nicolet公司；U1084A質(zhì)譜儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 蘿卜花青素凍干粉制備純化

0.5 g市售蘿卜紅色素先用100 mL蒸餾水分散，再過0.22 μm微孔濾膜，濾液用截留分子質(zhì)量為3 kDa的超濾膜于0.2 MPa超濾，濾液用恒流泵以70 r/min的流速泵入活化XAD-4大孔吸附樹脂柱中，待吸附層達到樹脂柱1/2處時停止。接著用2 柱體積（BV）蒸餾水充分沖洗樹脂柱，除去小分子雜質(zhì)后用65%乙醇溶液為洗脫劑，以2 BV/h的流速進行洗脫，直到流出液無色為止。收集洗脫液并進行減壓濃縮，直到濃縮液無乙醇味時停止。最后，將濃縮液置于20 ℃預冷凍6 h后放入冷凍干燥機中，在-40～-50 ℃冷凍干燥24～36 h，即獲得純化蘿卜花青素凍干粉。

1.3.2 葡萄糖苷酶凍干粉制備純化

葡萄糖苷酶粗粉攪拌分散于100 倍體積的一級純凈水中，5 000 r/min離心10 min，取上清液，用截留分子質(zhì)量為100 kDa的超濾膜于0.2 MPa進行超濾，收集濾過液，再用截留分子質(zhì)量50 kDa的超濾膜在0.2 MPa壓力下超濾濃縮，直至基本無濾過液濾出時止。收集截留液，用一級純凈水稀釋至原體積后再次用截留分子質(zhì)量50 kDa濾膜在0.5 MPa壓力下超濾濃縮。如此反復操作3 次后，將收集的截留液置于-40 ℃、60 Pa條件下冷凍干燥24 h，獲得純化葡萄糖苷酶凍干粉，其酶活力為21 U/mg，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 蘿卜花青素酶修飾物制備

將制備的純化蘿卜花青素粉末先用200 倍體積的一級純凈水加熱溶解，配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液，再轉(zhuǎn)移入帶磁力攪拌、連接超級恒溫水浴的夾套反應器中，升溫至30 ℃后保溫15 min，接著加入質(zhì)量比0.001∶1～0.01∶1的純化葡萄糖苷酶凍干粉，在30～70 ℃、pH 2.0～7.0條件下反應80 min。反應完成后，迅速升溫反應液至80 ℃，保持10 min后再冷卻至常溫，然后3 000 r/min離心10 min。收集離心上清液。于XAD-4大孔吸附樹脂柱進行進一步純化，上柱、純凈水洗滌及洗脫條件均同1.3.1節(jié)。收集洗脫液進行減壓真空濃縮和冷凍干燥，減壓真空濃縮和冷凍干燥的條件均同1.3.1節(jié)。冷凍干燥完成后，即制備出蘿卜花青素酶修飾物。蘿卜花青素酶修飾物的產(chǎn)率見式（1）：

1.3.4 還原糖含量測定

精確稱取定量試樣，按照仝瑛等[20]采用的DNS法測定蘿卜花青素酶修飾物還原糖含量。

1.3.5 制備蘿卜花青素酶修飾物的工藝條件

設(shè)定質(zhì)量濃度為5 mg/mL的純化蘿卜花青素溶液體積200 mL，反應時間80 min，葡萄糖苷酶/蘿卜花青素質(zhì)量比0.005∶1、pH 5.0、反應溫度50 ℃，固定其他條件，分別考察pH值、葡萄糖苷酶/蘿卜花青素質(zhì)量比、反應溫度對酶修飾物產(chǎn)率的影響。

1.3.6 制備蘿卜花青素酶修飾物的正交試驗

根據(jù)單因素試驗確定的范圍，選擇pH值、葡萄糖苷酶/蘿卜花青素質(zhì)量比、反應溫度作為考察的3 個因素，每個因素3 個水平，以蘿卜花青素酶修飾物產(chǎn)率為考察指標，用L9（34）正交試驗表得出最佳制備條件。

1.3.7 蘿卜花青素酶修飾物分析

1.3.7.1 紅外光譜分析

取蘿卜花青素粉末少量，取少許干燥試樣，加入適量KBr，用瑪瑙研缽仔細研磨后壓片，用紅外光譜儀在4 000～500 cm-1范圍掃描分析紅外光譜。

1.3.7.2 高效液相色譜分析

實驗采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，紫外檢測波長525 nm，進樣量10 μL，流動相：A相（0.1%甲酸溶液）；B相（甲醇），梯度洗脫條件：0～10 min 5%～30% B相；10～30 min 30% B相。

1.3.7.3 質(zhì)譜分析

質(zhì)譜條件：Thermo LXQ型離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，質(zhì)譜為電噴霧離子源正離子模式；離子源溫度100 ℃；針電壓4.5 kV；毛細管電壓20 V；毛細管溫度300 ℃；離子肼質(zhì)量分析器，且掃描質(zhì)量范圍m/z 100～1 000。

1.3.7.4 溶解性測定

準確稱取1.0 g蘿卜花青素原料粉末，分別加入100 mL的4 ℃冷水和65%乙醇溶液中，充分攪拌30 min后，3 000 r/min離心10 min，收集截留物干燥后稱取質(zhì)量，按式（2）計算其溶解率：

1.3.7.5 抗氧化能力測定

采用溴鄰苯三酚紅氧化法[21-22]測定蘿卜花青素及其酶修飾物清除羥自由基的能力，并與原花青素B2進行比較。

1.3.7.6 人肝癌細胞株MHCC97L的生長抑制實驗

精確稱取定量試樣，按照孫振亞等[23]介紹的方法測定蘿卜花青素酶修飾物對人肝癌細胞株MHCC97L的生長抑制作用。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，圖像采用Origin 8.0繪圖軟件進行處理。每組實驗獨立重復3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜花青素結(jié)構(gòu)分析

由圖1a可知，蘿卜紅色素（525 nm波長）由多種物質(zhì)組成且分離效果優(yōu)良。由圖1b可知，純化蘿卜花青素僅有一個主峰，出峰時間為4.97 min，峰面積占92.6%。這說明使用膜分離和XAD-4大孔樹脂可以制備出純度較高的蘿卜花青素。從圖1c可知，出現(xiàn)了m/z分別為448、433、339等峰，蘿卜花青素黃酮母核相對分子質(zhì)量為287，蘿卜紅色素單糖苷的相對分子質(zhì)量為449，蘿卜花青素雙糖苷的相對分子質(zhì)量為611，形成質(zhì)子化準分子負離子m/z為610，與圖譜中的610處峰對應；其先失去一個羥基之后的碎片負離子m/z 590，對應圖譜中589處峰；繼續(xù)丟失B環(huán)后的碎片負離子m/z 482，對應圖譜中480處峰。蘿卜花青素雙糖苷失去一個羥基再失去一個糖苷后的碎片負離子m/z為449，對應圖譜中448處峰；繼續(xù)丟失B環(huán)后的碎片負離子m/z 340，對應圖譜中340處峰，說明純化蘿卜花青素中的主要物質(zhì)為蘿卜花青素雙糖苷。

圖1 蘿卜花青素結(jié)構(gòu)分析Fig. 1 Structural analysis of purified radish anthocyanin

2.2 蘿卜花青素酶修飾物的表征

2.2.1 紅外光譜分析

圖2 蘿卜花青素酶修飾物的紅外圖譜Fig. 2 IR spectra of radish anthocyanin modified by glucosaccharase

由圖2可知，在D區(qū)（1 639、1 599、1 513、1 445 cm-1）的吸收峰為蘿卜花青素中苯并吡喃的芳環(huán)和雜環(huán)的骨架振動，B區(qū)（1 268、1 173、1 073 cm-1）的吸收峰為糖環(huán)中碳氧鍵的伸縮振動吸收峰（C—O—C）。純化的蘿卜花青素A區(qū)（834 cm-1）為吡喃糖苷的特征吸收峰，C區(qū)（1 336 cm-1）吸收峰為2 個糖環(huán)之間的碳氧鍵伸縮振動吸收峰（C—O—C），而蘿卜花青素酶修飾物A區(qū)處吸收峰明顯減弱，C區(qū)處吸收峰消失，且在B區(qū)處吸收峰強度明顯弱于純化的蘿卜花青素。這說明一分子葡萄糖從蘿卜花青素分子中被葡萄糖苷酶成功水解。

2.2.2 質(zhì)譜分析

圖3 蘿卜花青素酶修飾物的質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectrum of radish anthocyanin modified by glucosaccharase

從圖3可知，蘿卜花青素單糖苷相對分子質(zhì)量為449，形成質(zhì)子化準分子負離子m/z為448，與圖譜中的448處峰對應；蘿卜花青素單糖苷失去一個羥基之后的碎片負離子m/z 433，對應圖譜中432處峰；繼續(xù)丟失B環(huán)后的碎片負離子m/z 339，對應圖譜中339處峰。由此證明蘿卜花青素的酶修飾產(chǎn)物為蘿卜花青素單糖苷，同樣也證明糖苷酶修飾蘿卜花青素的水解反應具有高度專一性。

2.3 蘿卜花青素酶修飾條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 單因素試驗結(jié)果

由圖4可以看出，當pH值在2～5區(qū)間時，蘿卜花青素酶修飾物產(chǎn)率隨著pH值升高而增加；當pH值超過5，產(chǎn)率則隨pH值升高而降低。從過程科學的角度分析，pH值對酶促反應的影響可歸納為對酶與底物的結(jié)合及對催化反應的控制[24]。一方面pH值控制酶和底物分子可解離的側(cè)鏈基團或羥基極性基團等，這些基團隨著pH值的變化處于不同的解離狀態(tài)，進而影響酶分子的構(gòu)象和與底物分子的“契合”；另一方面pH值也影響反應體系的狀態(tài)，最終影響酶促反應。pH值的變化也會影響酶的空間結(jié)構(gòu)，從而影響酶的反應活性。由此可見葡萄糖苷酶的最適反應pH值為4～6的弱酸環(huán)境。

由圖4b可以看出，葡萄糖苷酶/蘿卜花青素質(zhì)量比為0.001∶1時，酶修飾物產(chǎn)率為50.28%；當葡萄糖苷酶/蘿卜花青素質(zhì)量比增加到0.005∶1時，酶修飾物產(chǎn)率達到72.61%，再增加葡萄糖苷酶比例，酶修飾物產(chǎn)率呈水平線趨勢，增長緩慢，初步確定葡萄糖苷酶/蘿卜花青素的質(zhì)量比在0.005∶1～0.01∶1之間。

由圖4c可以看出，在反應溫度為30～40 ℃區(qū)間內(nèi)，酶修飾物產(chǎn)率隨著反應溫度的升高而增加；在溫度區(qū)間40～50 ℃時，酶修飾物產(chǎn)率增長變緩；當溫度區(qū)間為50～60 ℃時，酶修飾物產(chǎn)率隨著反應溫度的升高而逐漸降低；繼續(xù)增加溫度，酶修飾物產(chǎn)率急速下降。這是由于溫度是影響酶活性的重要因素之一，升高溫度可以增加底物的熱能[25]，增加蘿卜花青素的水解速率；但是隨著溫度的升高，增加了酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子熱能，最終導致了酶的變性。因此，該酶對蘿卜花青素的最佳作用溫度為40～60 ℃。

圖4 葡萄糖苷酶修飾蘿卜花青素的優(yōu)化條件Fig. 4 Optimization of reaction parameters for anthocyanin modification

2.3.2 制備蘿卜花青素酶修飾物的正交試驗結(jié)果

2.3.2.1 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定正交試驗的因素水平如表1所示，研究pH值、葡萄糖苷酶/蘿卜花青素質(zhì)量比、反應溫度對酶修飾物產(chǎn)率的影響，以獲得最佳工藝條件，結(jié)果如表2所示。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used for orthogonal array design

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

對正交試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 正交試驗方差分析Table 3 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

由表3可知，因素A對試驗結(jié)果有極顯著影響，因素C對試驗結(jié)果有顯著的影響，這主要歸因于pH值和反應溫度顯著影響葡萄糖苷酶的活性；因素B對試驗結(jié)果無顯著影響?？紤]到正交試驗的結(jié)果，選擇A2B2C2為最優(yōu)組，即pH 5.0、葡萄糖苷酶/蘿卜花青素質(zhì)量比0.007∶1、反應溫度50 ℃為最優(yōu)方案。

2.3.2.2 驗證實驗結(jié)果

采用優(yōu)化后的工藝條件，反應時間為80 min進行3 次驗證實驗，測得蘿卜花青素酶修飾物產(chǎn)率為74.86%，優(yōu)于正交試驗中的任何一個組合，故確定pH 5.0、葡萄糖苷酶/蘿卜花青素質(zhì)量比0.007∶1、反應溫度50 ℃為葡萄糖苷酶修飾蘿卜花青素的最優(yōu)條件。

2.4 蘿卜花青素酶修飾物溶解性

從表4可知，純化蘿卜花青素在4 ℃冷水和65%乙醇溶液中的溶解率分別較蘿卜紅色素粗品提高15.18%和11.01%，這是由于蘿卜花青素的溶解性主要受疏水相互作用和氫鍵影響，而超濾膜處理僅除去蘿卜紅色素粗品中的大分子，大孔吸附樹脂也只能除去還原糖和異硫氰酸酯等小分子雜質(zhì)。糖苷酶處理的蘿卜花青素在4 ℃冷水和65%乙醇溶液中的溶解率較純化蘿卜花青素分別提高115.38%和58.55%。純化蘿卜紅色素為天竺葵素的糖苷[1-2]，其槐二糖基上的羥基既是氫鍵供體又是氫鍵受體，該糖配基上的羥基越多，形成分子間氫鍵的數(shù)量越多，這有利于配體天竺葵素母核相互“臨近”而發(fā)生疏水相互作用，導致冷水可溶性降低[26]。在糖苷酶催化下，蘿卜花青素二糖苷的槐二糖配基水解，生成蘿卜花青素單葡萄糖苷。由于該殘存的葡萄糖配基僅剩4 個游離羥基，游離羥基減少率達42.86%，作用空間也較槐二糖基幾乎縮小1/2，因此，該糖配基除難以形成分子內(nèi)氫鍵外，形成分子間氫鍵的數(shù)量和能力也顯著降低，這反過來又削弱了天竺葵素母核間形成平面疏水相互作用的能力，故蘿卜花青素二糖苷的糖苷酶修飾物-蘿卜花青素單葡萄糖苷的冷水可溶性顯著提升，在4 ℃冷水中的溶解率至少提升53.57%，在65%乙醇溶液中的溶解率至少提升36.93%。

表4 蘿卜花青素酶修飾物的溶解率Table 4 Solubility of radish anthocyanin modified by glucosaccharase

2.5 蘿卜花青素酶修飾物的抗氧化能力

圖5 蘿卜花青素、蘿卜花青素酶修飾物和原花青素B2羥自由基清除能力Fig. 5 Hydroxyl radical scavenging capacity of radish anthocyanin,radish anthocyanin modified by glucosaccharase and procyanidine B2

羥自由基會導致組織細胞損傷，人體會通過新陳代謝產(chǎn)生羥自由基，從而導致機體膜過氧化和蛋白質(zhì)交聯(lián)變性、核酸損傷等危害，對人體有很大的毒性[27]。原花青素B2是葡萄籽原花青素的重要提取物之一，具有強大的抗氧化能力[28-29]。從圖5可以看出，蘿卜花青素、酶修飾物和原花青素B2的羥自由基清除能力都隨著抗氧化劑的濃度增大而增大。當抗氧化劑濃度相同時，酶修飾物的羥自由基清除率明顯高于蘿卜花青素，但是略低于原花青素B2。顯然，這是由于三者的結(jié)構(gòu)差異所致。原花青素B2無糖配基，其酚羥基數(shù)多并直接面臨氧化劑的作用；蘿卜花青素的配基為槐二糖，蘿卜花青素酶修飾物的配基則為葡萄糖，糖配基的存在會增加空間位阻效應[30]，影響氧化劑“臨近”，降低其抗氧化能力；配基體積越大，效應可能越強。因此，原花青素B2的抗氧化能力最強，純化蘿卜花青素酶修飾物次之，而純化蘿卜花青素最低。

2.6 蘿卜花青素酶修飾物對MHCC97L細胞的生長抑制作用

圖6 不同濃度的蘿卜花青素酶修飾物對MHCC97L細胞處理不同時間的生長抑制率Fig. 6 Cell growth inhibition effect of different concentrations of radish anthocyanin modified by glucosaccharase on hepatocellular carcinoma cells (MHCC97L) at different culture times

從圖6可以看出，用濃度為5～40 μmol/L的蘿卜花青素酶修飾物處理人體肝癌細胞MHCC97L 24～72 h，均可顯著抑制該細胞的生長，抑制率隨其劑量增加而增大。

3 結(jié) 論

利用膜分離和XAD-4大孔吸附樹脂純化蘿卜紅色素粗品，獲得主要成分為蘿卜花青素二糖苷的純化蘿卜花青素。用純化糖苷酶修飾純化蘿卜花青素，以蘿卜花青素酶修飾物產(chǎn)率為指標進行工藝條件優(yōu)化，研究pH值、葡萄糖苷酶/蘿卜花青素質(zhì)量比、反應溫度3 個工藝參數(shù)對糖苷酶修飾蘿卜花青素的影響，確定了糖苷酶修飾蘿卜花青素的最佳工藝條件為pH 5.0、葡萄糖苷酶/蘿卜花青素質(zhì)量比0.007∶1、反應溫度50 ℃，在此優(yōu)化條件下蘿卜花青素酶修飾物產(chǎn)率可達74.86%。進而驗證蘿卜花青素酶修飾物的溶解性，其在4 ℃冷水和65%乙醇溶液中的溶解率分別較純化蘿卜花青素提高115.38%和58.55%?？寡趸芰Ψ治霰砻?，蘿卜花青素酶修飾物對羥自由基具有良好的清除能力。此外，用濃度為5～40 μmol/L的蘿卜花青素酶修飾物處理人體肝癌細胞MHCC97L 24～72 h，均可顯著抑制該細胞的生長，抑制率隨其劑量增加而增大。參考文獻：

[1] 龐志申. 花色苷研究概況[J]. 北京農(nóng)業(yè)科學, 2000, 18(5): 37-42.

[2] BRIDLE P, TIMBERLAKE C F. Anthocyanins as natural food colours-selected aspects[J]. Food Chemistry, 1997, 58(1): 103-109.DOI:10.1016/S0308-8146(96)00222-1.

[3] WILLIAMS C A, GRAYER R J. Anthocyanins and other flavonoids[J]. Natural Product Reports, 2004, 21(4): 539-573.DOI:10.1039/b006257j.

[4] ARACELI C, MADELOURDES P H, MAELENA P, et al. Chemical studies of anthocyanins: a review[J]. Food Chemistry, 2009, 113(4):859-871. DOI:10.1016/j.foodchem.2008.09.001.

[5] KHOO H E, AZLAN A, TANG S T, et al. Anthocyanidins and anthocyanins: colored pigments as food, pharmaceutical ingredients,and the potential health benefits[J]. Food & Nutrition Research, 2017,61(1): 1-21. DOI:10.1080/16546628.2017.1361779.

[6] 宋長春. 蘿卜紅天然食用色素的提取及理化性質(zhì)的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2001, 27(8): 31-33. DOI:10.3321/j.issn:0253-990X.2001.08.009.

[7] 劉詠秋, 曾政權(quán). 一種優(yōu)質(zhì)的天然食用色素—精制蘿卜紅性能研究[J]. 重慶大學學報(自然科學版), 1999, 22(2): 131-136.

[8] 董全, 李洪軍, 尚永彪, 等. 食用天然色素-蘿卜紅研究進展[J]. 保鮮與加工, 2004, 4(6): 9-11. DOI:10.3969/j.issn.1009-6221.2004.06.006.[9] 李平凡, 姚勇芳. 蘿卜花色苷的結(jié)構(gòu)研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2014,10(4): 40-43.

[10] 呂鋒. 紫蘿卜花色苷的提取、結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和抗氧化性研究[D].南昌: 南昌大學, 2007. DOI:10.7666/d.y1238795.

[11] JULIA M B, PURIFICACIóN S P, FERNANDO R E, et al. Analysis and antioxidant capacity of anthocyanin pigments. Part II: chemical structure,color, and intake of anthocyanins[J]. Critical Reviews in Analytical Chemistry, 2012, 42(2): 126-151. DOI:10.1080/10408347.2011.632314.

[12] 崔永巖, 陳公安. 蛋白質(zhì)的改性和力學加工性能的研究[J]. 塑料加工, 2007, 42(1): 16-18.

[13] 陳立德. 肌原纖維蛋白凝膠作用力影響因素的研究[D]. 重慶: 西南大學, 2010. DOI:10.7666/d.y1670862.

[14] LEI C, HUI T, XIE Z, et al. Modifications of dietary flavonoids towards improved bioactivity: an update on structure-activity relationship[J]. Critical Reviews in Food Science & Nutrition, 2016,58(4): 1-15. DOI:10.1080/10408398.2016.1196334.

[15] 黃鑫, 梁劍平, 郝寶成. 黃酮類化合物的分子修飾與構(gòu)效關(guān)系的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2015(11): 57-61.

[16] 姜忠義, 許松偉, 吳洪. 天然產(chǎn)物的酶法結(jié)構(gòu)修飾[J]. 有機化學,2002, 22(3): 220-226. DOI:10.3321/j.issn:0253-2786.2002.03.012.

[17] 周坤. 糖苷酶與糖基轉(zhuǎn)移酶催化轉(zhuǎn)糖反應的特征與機理研究[D].北京: 中國科學院大連化學物理研究所, 2013.

[18] 鄭美瑜, 陸勝民, 陳劍兵, 等. 糖苷酶對橙皮苷和柚皮苷的酶解作用研究[J]. 中國食品學報, 2010, 10(4): 141-146. DOI:10.3969/j.issn.1009-7848.2010.04.022.

[19] 盛占武, 金志強, 高錦合, 等. 響應面法優(yōu)化橙皮苷酶法改性工藝研究[J]. 中國食品學報, 2010, 10(4): 202-210. DOI:10.3969/j.issn.1009-7848.2010.04.031.

[20] 仝瑛, 倪士峰, 劉建利, 等. DNS法測定菊芋中還原糖含量的研究[J]. 陜西中醫(yī), 2009, 30(11): 1535-1537. DOI:10.3969/j.issn.1000-7369.2009.11.074.

[21] 吳南, 任鳳蓮, 吳心傳. H2O2-Co2+產(chǎn)生的羥自由基的溴鄰苯三酚紅氧化法檢測[J]. 分析測試學報, 2001, 20(2): 52-54. DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2001.02.015.

[22] 孫振亞, 麥彩鈴, 劉昌偉, 等. 腫瘤壞死因子α對人肝癌細胞株MHCC-97L侵襲能力的影響[J]. 醫(yī)學分子生物學雜志, 2013, 10(2):105-108. DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2013.02.009.

[23] 何玲玲, 王新, 石中亮, 等. 水提板栗殼色素對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除作用[J]. 食品與機械, 2006, 22(6): 56-57.DOI:10.3969/j.issn.1003-5788.2006.06.017.

[24] 陳銀霞. 影響酶促反應速度的外因研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2008(18): 238-239. DOI:10.3969/j.issn.1007-5739.2008.18.166.

[25] 嚴少敏, 師德強, 農(nóng)浩, 等. 貝塔-葡萄糖苷酶催化反應的最適pH值和最適溫度的同時預測[J]. 廣西科學, 2011, 18(3): 253-260.DOI:10.3969/j.issn.1005-9164.2011.03.020.

[26] 王瑞芳, 鄭焰, 馬軍隆, 等. 水溶性疏水締合聚合物的合成及其性質(zhì)分析[J]. 油氣地質(zhì)與采收率, 2004, 11(2): 54-55. DOI:10.3969/j.issn.1009-9603.2004.02.018.

[27] DIZDAROGLU M. Chemical determination of free radical-induced damage to DNA[J]. Free Radical Biology & Medicine, 1991, 10(3/4):225-242. DOI:10.1016/0891-5849(91)90080-M.

[28] 辛立波, 李曉波, 於洪建, 等. 葡萄籽低聚原花青素化學成分及抗氧化研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2012, 33(8): 40-43. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2012.08.012.

[29] ZHANG J Q, GAO B W, JING W, et al. Critical role of FoxO1 in ganulosa cell apoptosis caused by oxidative stress and protective effects of grape seed procyanidin B2[J]. Oxidative Medicine &Cellular Longevity, 2016(4): 1-16. DOI:10.1155/2016/6147345.

[30] 林親錄, 施兆鵬. 類黃酮與酚酸等天然抗氧化劑的結(jié)構(gòu)與其抗氧化力的關(guān)系[J]. 食品科學, 2001, 22(6): 85-91. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2001.06.025.