QuPPe-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜中呋蟲(chóng)胺及其代謝物殘留

吳延燦，蔣冰心，施艷紅*，戚傳勇，操海群，唐 俊，商魯寧，蘇漪玲

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.合肥市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)檢驗(yàn)中心，安徽 合肥 230091；3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，安徽 合肥 230036）

呋蟲(chóng)胺是日本三井化學(xué)公司研發(fā)的第三代煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑，與現(xiàn)有的煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑結(jié)構(gòu)相比，它的四氫呋喃基取代了以前的氯代吡啶基、氯代噻唑基，并不含鹵族元素[1-2]。呋蟲(chóng)胺殺蟲(chóng)廣譜，主要作用于昆蟲(chóng)的乙酰膽堿受體，阻斷正常的神經(jīng)傳遞，從而使昆蟲(chóng)死亡[3-4]，自2002年上市后便廣泛用于防治水稻、蔬菜和水果上的各種害蟲(chóng)，如飛虱、蚜蟲(chóng)、葉蟬等[5]。截止2017年7月底，我國(guó)批準(zhǔn)登記的呋蟲(chóng)胺產(chǎn)品已達(dá)78 個(gè)，主要登記使用在水稻、茶樹(shù)、番茄、黃瓜、甘藍(lán)和馬鈴薯等作物上[6]。研究發(fā)現(xiàn)，呋蟲(chóng)胺會(huì)在植物中代謝產(chǎn)生1-甲基-3-[（3-四氫呋喃）甲基]二氫胍鹽（1-methyl-3-(tetrahydro-3-furylmethyl) guanidium dihydrogen，DN）、1-甲基-3-[（3-四氫呋喃）甲基]脲（1-methyl-3-(tetrahydro-3-furylmethyl) urea，UF）等物質(zhì)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。這些代謝物的毒性與母體大致相同，并且比母體表現(xiàn)出更強(qiáng)的遷移性和持久性[5]。2017年6月18日起實(shí)施的GB 2763—2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中[7]，僅對(duì)呋蟲(chóng)胺在稻米（2 mg/kg）、糙米（1 mg/kg）、棉籽（1 mg/kg）、黃瓜（2 mg/kg）中的最大殘留限量（maximum residue limits，MRL）值進(jìn)行了限定，但是對(duì)其他登記使用的農(nóng)作物品種尚未制定MRL值，并且在殘留定義這一項(xiàng)上只明確了呋蟲(chóng)胺母體，而對(duì)代謝物DN、UF并沒(méi)有做要求。

目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道呋蟲(chóng)胺的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫[5]、高效液相色譜法[8-12]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-21]，但是，同時(shí)分析呋蟲(chóng)胺及其代謝物DN、UF的方法報(bào)道較少，目前僅報(bào)道了水稻[22-23]、蜂產(chǎn)品[24]、甜瓜[25]以及茶葉[26]上的殘留分析方法，還鮮見(jiàn)蔬菜中呋蟲(chóng)胺及其代謝物的殘留分析方法報(bào)道。近年來(lái)呋蟲(chóng)胺農(nóng)藥產(chǎn)品在蔬菜上的登記使用越來(lái)越廣泛，為有效監(jiān)測(cè)蔬菜中呋蟲(chóng)胺及其代謝物的殘留情況，保障群眾的消費(fèi)安全，急需建立蔬菜中呋蟲(chóng)胺及其代謝物的快速檢測(cè)方法。

QuPPe方法是歐盟農(nóng)藥殘留參考實(shí)驗(yàn)室Anastassiades等[27]于2013年公布的一種采用甲醇提取植物源食品中極性農(nóng)藥的快速分析方法，目前該方法已經(jīng)被應(yīng)用到植物中三唑類(lèi)殺菌劑[28]、草銨膦[29]和高氯酸鹽[30]等極性化合物的研究中。呋蟲(chóng)胺及其代謝物屬于極性較大的一類(lèi)化合物。Rahmana等[26]研究發(fā)現(xiàn)甲醇是提取茶葉樣品中呋蟲(chóng)胺及其代謝物最好的溶劑。因此，本研究采用QuPPe分析超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測(cè)，建立黃瓜、番茄、甘藍(lán)、馬鈴薯等登記產(chǎn)品中呋蟲(chóng)胺及其代謝物DN、UF的殘留分析方法，該方法簡(jiǎn)單、高效，能快速、準(zhǔn)確地對(duì)蔬菜樣品進(jìn)行定量分析，以期為農(nóng)產(chǎn)品中呋蟲(chóng)胺及其代謝物的日常監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)保障。

圖1 呋蟲(chóng)胺及其代謝物DN、UF化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of dinotefuran, DN and UF

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔬菜樣品購(gòu)于合肥市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

呋蟲(chóng)胺（純度99.50%） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；DN（純度97.0%）、UF（純度97.0%） 北京勤誠(chéng)亦信科技開(kāi)發(fā)公司；甲醇、甲酸（均為色譜純） 美國(guó)Tedia公司；乙酸（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為密理博超純水系統(tǒng)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC Xevo TQ超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源）、ACQUITY BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 美國(guó)Waters公司；ROTINA380離心機(jī) 德國(guó)Hettich Zentrifugen公司；VB424多位脈沖渦旋振蕩器 德國(guó)Wiggens公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取呋蟲(chóng)胺、DN、UF標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的母液。同時(shí)，用甲醇稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L），4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩７謩e用不同基質(zhì)的空白提取液逐級(jí)稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成1.25、5、12.5、50、125、500 μg/L系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 g樣品（甘藍(lán)取5.0 g）于50 mL離心管中，加入10 mL 1%乙酸的甲醇溶液后渦旋提取2 min（2 500 r/min），以4 000 r/min離心5 min，取上清液到25 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，混勻后過(guò)0.22 μm親水性濾膜，供UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.3.3 UPLC條件

分離采用ACQUITY BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。流動(dòng)相A為0.05%甲酸溶液，流動(dòng)相B為0.05%甲酸-甲醇溶液；梯度洗脫程序：0～0.25 min，70% A；3～4 min，5% A；4.01～5 min，70% A；運(yùn)行時(shí)間5 min；流速0.25 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

1.3.4 MS條件

電噴霧離子源，正離子模式；毛細(xì)管電壓3.0 kV；離子源溫度150 ℃；錐孔反吹氣流量50 L/h；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流量700 L/h；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 MS條件的優(yōu)化

配制1 mg/L呋蟲(chóng)胺、DN、UF單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，在全掃確定母離子后，采用儀器自動(dòng)調(diào)諧模塊對(duì)各目標(biāo)化合物進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化，從而得到最優(yōu)測(cè)定條件，見(jiàn)表1。

表1 呋蟲(chóng)胺及其代謝物的測(cè)定條件Table 1 Optimized working parameter of ESI-MS/MS for dinotefuran and its metabolites

2.2 色譜條件的選擇

針對(duì)極性化合物弱保留的特點(diǎn)，Anastassiades等[27]推薦使用的為常規(guī)實(shí)驗(yàn)室不常備的陰離子交換色譜柱（Ionpac AS 11、Ionpac AS 11-HC）以及多孔滲水石墨柱（Hypercarb）。研究發(fā)現(xiàn)，采用100 mm規(guī)格的ACQUITY BEH C18色譜柱，通過(guò)降低流速（0.25 mL/min），調(diào)整流動(dòng)相初始比例（與前處理方法相適應(yīng)），可以獲得呋蟲(chóng)胺及其代謝物較好的保留和峰形；加入甲酸可以提高呋蟲(chóng)胺及其代謝物的離子化效率，從而提高響應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖2所示。

圖2 呋蟲(chóng)胺及其代謝物定量離子圖譜Fig. 2 Quantitative ion chromatograms of dinotefuran and its metabolites

2.3 提取方法的優(yōu)化

目前，同時(shí)測(cè)定呋蟲(chóng)胺及其代謝物的方法報(bào)道較少，大多數(shù)方法采用乙腈[26]或乙腈-甲醇混合溶液[22]提取，經(jīng)過(guò)基質(zhì)固相分散萃取[26]或固相萃取[22]等方式凈化后再測(cè)定，步驟較為繁瑣。相對(duì)于乙腈，甲醇的共提物更少，提取液幾乎清澈透明，并且對(duì)于極性化合物呋蟲(chóng)胺及其代謝物有更好的提取效率[26]，因此本研究借鑒QuPPe方法[27]，選用酸化甲醇作為提取劑，采用抗干擾能力強(qiáng)的UPLC-MS/MS聯(lián)用測(cè)定。蔬菜樣品經(jīng)提取后，用超純水定容25 mL，不僅保證了待測(cè)液與流動(dòng)相初始比例相似從而獲得更好的峰形，而且稀釋提取液也同時(shí)降低基質(zhì)本底的干擾。甘藍(lán)樣品相對(duì)于其他樣品提取效率較低，當(dāng)取樣量和提取劑比例為1∶1時(shí)，呋蟲(chóng)胺和DN的回收率均低于70%，因此本研究將甘藍(lán)樣品的取樣量和提取劑比例調(diào)整為1∶2。

2.4 線性范圍與檢出限測(cè)定結(jié)果

用黃瓜、番茄、馬鈴薯、甘藍(lán)4 種蔬菜的空白基質(zhì)提取液配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（1.3.1節(jié)），采用UPLC-MS/MS進(jìn)行分析，分別以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；對(duì)低質(zhì)量濃度（1.25 μg/L）基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，以3 倍信噪比確定方法的檢出限，10 倍信噪比確定方法的定量限。如表2所示，在1.25～500 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，呋蟲(chóng)胺及其代謝物的相關(guān)系數(shù)均大于0.991 4，方法檢出限為0.04～0.66 μg/L，方法定量限為0.13～2.20 μg/L，見(jiàn)表2。

表2 線性范圍與檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, linear regression equations, correlation coefficients (R2), LODs, and LOQs

2.5 方法的回收率和精密度結(jié)果

表3 呋蟲(chóng)胺及其代謝物的加標(biāo)回收率及精密度（n=5）Table 3 Recoveries and precisions (RSD) of dinotefuran and its metabolites from spiked samples (n= 5)

在空白基質(zhì)中做添加回收實(shí)驗(yàn)，添加水平分別為10、100 μg/kg和1 000 μg/kg，每個(gè)添加水平重復(fù)5 次。如表3所示，在黃瓜、番茄、馬鈴薯、甘藍(lán)4 種蔬菜中，呋蟲(chóng)胺及其代謝物的添加回收率為72.0%～109.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.4%～12.8%。呋蟲(chóng)胺及其代謝物DN、UF在黃瓜、番茄、馬鈴薯、甘藍(lán)4 種蔬菜中的最低添加量均為10 μg/kg。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)測(cè)定結(jié)果

表4 呋蟲(chóng)胺及其代謝物的基質(zhì)效應(yīng)（n=3）Table 4 Matrix effects of dinotefuran and its metabolites (n= 3)

本研究考察黃瓜、番茄、馬鈴薯和甘藍(lán)4 種蔬菜基質(zhì)中呋蟲(chóng)胺及其代謝物DN、UF的基質(zhì)效應(yīng)，分別用溶劑（甲醇-水，2∶3，V/V）和空白基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，設(shè)置12.5 μg/kg（低含量）和125 μg/kg（高含量）以考察不同含量條件下基質(zhì)效應(yīng)是否一致，各連續(xù)測(cè)定3 次。如表4所示，DN在黃瓜基質(zhì)中表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)（0.8≤MEF≤1.2），在番茄和甘藍(lán)基質(zhì)中表現(xiàn)為中等強(qiáng)度基質(zhì)效應(yīng)（0.5＜MEF＜0.8），在馬鈴薯基質(zhì)中表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)（MEF≤0.5）。UF在4 種蔬菜基質(zhì)中均表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)（1.5≤MEF）。呋蟲(chóng)胺在馬鈴薯基質(zhì)中表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)（0.8≤MEF≤1.2）；在番茄基質(zhì)中，低濃度表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)（0.8≤MEF≤1.2），高濃度表現(xiàn)為中等強(qiáng)度基質(zhì)效應(yīng)（1.2＜MEF＜1.5）；在甘藍(lán)基質(zhì)中表現(xiàn)為中等強(qiáng)度基質(zhì)效應(yīng)（1.2＜MEF＜1.5）；在黃瓜基質(zhì)中，低濃度表現(xiàn)為中等強(qiáng)度基質(zhì)效應(yīng)（1.2＜MEF＜1.5），高濃度表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)（1.5≤MEF）。DN普遍表現(xiàn)為基質(zhì)減弱效應(yīng)（MEF≤1），UF和呋蟲(chóng)胺普遍表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)（1≤MEF）。在本研究設(shè)置的2 個(gè)含量條件下，UF和呋蟲(chóng)胺在高含量條件下的基質(zhì)效應(yīng)要高于低含量，但是差異不顯著（P＜0.05）?？紤]到不同蔬菜基質(zhì)對(duì)呋蟲(chóng)胺及其代謝物結(jié)果影響較大，為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，在實(shí)際樣品的檢測(cè)過(guò)程中，需要使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液才能有效的補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)所銷(xiāo)售的24 件蔬菜樣品（番茄7 件、黃瓜7 件、馬鈴薯5 件、甘藍(lán)5件）中呋蟲(chóng)胺及其代謝物的殘留量進(jìn)行分析，其中有1 件黃瓜樣品中檢出呋蟲(chóng)胺，含量為10 μg/kg，DN含量為117 μg/kg，小于GB/T 2763—2016規(guī)定最大殘留限量值2 mg/kg，其他樣品中呋蟲(chóng)胺及其代謝物未檢出。

3 結(jié) 論

目前鮮見(jiàn)針對(duì)蔬菜樣品中呋蟲(chóng)胺及其代謝物檢測(cè)方法的報(bào)道，而從近期的農(nóng)藥品種登記情況來(lái)看，呋蟲(chóng)胺產(chǎn)品已經(jīng)被登記使用在番茄、黃瓜、甘藍(lán)、馬鈴薯等蔬菜品種上。本實(shí)驗(yàn)參考?xì)W盟農(nóng)藥殘留參考實(shí)驗(yàn)室于2013年發(fā)布的針對(duì)極性農(nóng)藥的QuPPe分析方法，建立了QuPPe-UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定蔬菜中呋蟲(chóng)胺及其代謝物農(nóng)藥殘留的方法，該方法簡(jiǎn)單、快速，可滿足蔬菜中呋蟲(chóng)胺及其代謝物的快速篩查和定量分析要求。與傳統(tǒng)方法相比，QuPPe方法更加簡(jiǎn)單快速，結(jié)合UPLC-MS/MS檢測(cè)，可以廣泛應(yīng)用于一些水果蔬菜基質(zhì)中極性農(nóng)藥的快速批量分析。