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      基于Luminex平臺的非洲流行的病毒性出血熱IgG抗體多重檢測方法的初步建立

      2018-10-10 07:33:20蕪為劉洋張全福李川梁米芳李建東李德新
      中華實驗和臨床病毒學雜志 2018年3期
      關鍵詞:偶聯微球抗原

      蕪為 劉洋 張全福 李川 梁米芳 李建東 李德新

      近年來,隨著中非友誼的不斷加深,中非間的經貿往來也不斷增多。尤其是“一帶一路”戰(zhàn)略將中非間的交往推向了一個新的高度。但這同樣帶來了諸多公共衛(wèi)生方面的問題,很多流行于非洲大陸的傳染病也會趁機流入我國,這其中就有不少與病毒性出血熱相關的疾病,例如埃博拉出血熱、拉沙熱、克里米亞剛果出血熱、裂谷熱、黃熱等[1]。2016年,各有11例黃熱病例和1例裂谷熱病例從非洲輸入我國。這就要求相關單位采取積極的應對措施,包括開發(fā)有效的實驗室檢測試劑。

      Luminex多重懸浮芯片檢測技術作為標準化的高通量檢測平臺,可實現同時快速檢測100種靶標,敏感度高,特異度強,樣本用量少,目前已應用于多個領域,如細胞因子檢測[2],感染性疾病檢測[3],抗體和疫苗的研發(fā)[4],核苷酸多態(tài)性分析[5]等。 本研究首次將Luminex多重檢測技術應用于非洲流行的病毒性出血熱血清學的檢測,這些病毒主要包括克里米亞剛果出血熱病毒(CCHFV)、裂谷熱病毒(RVFV)、拉沙熱病毒(LASV)、盧約病毒(LUJV)、埃博拉病毒(EBOV)、馬爾堡病毒(MBGV)、登革熱病毒(DENV)和黃熱病毒(YFV)。初步建立了針對這些病毒抗原相應IgG抗體的快速、敏感、高通量的特異性檢測方法,為最終實現鑒別診斷提供了理論依據。

      1 材料與方法

      1.1 病毒基因、臨床血清樣本及動物血清 登革病毒 rEⅢ基因提取自患者血清,CCHFV、RVFV、LASV、LUJV核蛋白(NP)基因,EBOV、MBGV核蛋白基因和VP40基因,以及YFV rEⅢ基因由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成。動物血清由上述基因經原核系統重組表達的抗原免疫新西蘭大白兔制備。78份臨床血清樣本采自2014年埃博拉疫情暴發(fā)期間,有發(fā)熱癥狀的由非洲入境人員,但埃博拉核酸檢測均為陰性。114份陰性對照血清采自參加體檢的健康人。

      1.2 出血熱病毒抗原的表達及純化 將上述8種病毒的10個基因分別克隆至pET30 a載體,并轉化入BL21(DE3)感受態(tài)細胞,均勻涂布于含50 μg/ml卡那霉素抗性的固體LB培養(yǎng)基,37℃過夜培養(yǎng)后挑選出正確的克隆并接種至含50 μg/ml卡那霉素抗性的2xYT培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)至OD值達到0.6~0.8后加入IPTG至終濃度為1 mmol/L,30℃過夜培養(yǎng)。收獲細胞后用細胞裂解液重懸并超聲破碎,沉淀溶于8 mol/L尿素后過濾并經金屬鎳離子親和層析純化,收集目的蛋白并通過透析的方法緩慢去除尿素成分,使得蛋白得以復性。純化的11種病毒抗原經SDS-PAGE鑒定后分裝凍存于-80℃。

      1.3 重組抗原與熒光微球的偶聯 熒光微球與偶聯試劑均購自伯樂公司,每種病毒抗原偶聯一種熒光微球,偶聯方法參照公司提供的方法手冊,每次將大約20 μg的重組抗原偶聯至100 μl熒光微球(1.25×106個)。偶聯前需要在微球中加入10 μl N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-N-hydroxysulfosucc inimide,S-NHS,50 mg/ml)和 10 μl1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide,EDC,50 mg/ml),以活化微球的羧基端,從而與蛋白的氨基端進行共價偶聯。偶聯抗原的熒光微球可在4℃避光保存1年。

      1.4 重組抗原與熒光微球偶聯效果的評價 評價每種抗原的偶聯效果使用相應的兔血清。首先在96孔濾膜板每孔加入100 μl稀釋緩沖液(PBS+1%BSA)預濕,真空泵抽濾;加入100 μl稀釋緩沖液和12.5 μl含相應編碼微球的工作溶液(母液稀釋25倍,保證400個/μl,即每孔5 000個微球),真空泵抽濾;加入100 μl從1∶1 000開始4倍稀釋至1∶4 096 000的相應兔血清,陰性對照為相同比例稀的EV71-VP1免疫兔血清?;靹蚝笫覝乇芄庹駬u1 h,稀釋緩沖液反復洗滌并抽濾3次;加入50 μl按1∶100稀釋的PE標記的羊抗兔IgG,混勻后室溫避光振搖1 h,稀釋緩沖液反復洗滌并抽濾3次;加入125 μl的稀釋緩沖液,避光振搖1 min后用Bio-Plex 200懸浮芯片儀檢測。

      1.5 多重熒光微球檢測臨床血清樣本 在96孔濾膜板上每孔加入100 μl的稀釋緩沖液預濕濾膜,真空泵抽濾;加入100 μl的稀釋緩沖液和12.5 μl含10種熒光微球的工作溶液,真空泵抽濾;加入100 μl以1∶1 000稀釋的血清,包括78份臨床血清和114份正常人血清?;靹蚝笫覝乇芄庹駬u1 h,稀釋緩沖液反復洗滌并抽濾3次;加入50 μl按1∶100稀釋的藻紅蛋白標記的羊抗人IgG,后續(xù)步驟參見1.4。將陰性對照的平均值加3倍標準差定義為Cutoff值。

      1.6 多重熒光微球檢測技術與酶聯免疫吸附法的比較 將10種出血熱病毒重組抗原分別以每孔500 ng包被于96孔ELISA板并封閉。每種板同時檢測78份臨床血清和114份正常人血清,將每份血清1∶100稀釋后加入板中,每孔加入100 μl,37℃溫育1 h。PBST洗板后加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG抗體,37℃溫育1 h。PBST洗板后加入TMB顯色,用酶標儀測定反應板中每孔液體450 nm處的吸光度值(A450)。Cutoff值定義為陰性對照的平均值加3倍標準差,并將每種抗原檢測的數據與多重熒光微球檢測的數據做四格表卡方檢驗,用統計學軟件進行兩種方法的一致性分析。

      2 結果

      2.1 10種出血熱病毒抗原的表達與純化 分別收集表達10種出血熱病毒抗原的菌液并超聲,上清與沉淀分別進行SDS-PAGE檢測,結果顯示目的蛋白多存在于沉淀中,為包涵體表達。經過變復性并純化后通過SDS-PAGE鑒定,均呈現較單一的蛋白條帶,純度可以達到90%以上,達到檢測抗原的要求(結果未顯示)。

      2.2 單重熒光微球檢測兔血清評價偶聯效果 將10種病毒重組抗原分別偶聯熒光微球后,用Bio-Plex 200懸浮芯片儀單重檢測相應的多克隆兔血清以及用于陰性對照的EV71-VP1免疫的多克隆兔血清以評價偶聯效果。檢測結果說明大部分多克隆兔血清的IgG抗體滴度基本都能達到1比100萬以上,抗原偶聯成功,而所有抗原與陰性對照EV71-VP1兔免疫血清均無明顯免疫學反應,結果未顯示。

      2.3 多重熒光微球檢測臨床血清樣本 將10種病毒重組抗原分別偶聯相應的熒光微球后混合,利用懸浮芯片儀檢測了78份臨床血清和114份正常人血清IgG抗體。每種抗原均檢測了上述兩組樣本,以檢測正常人血清的平均值加3倍標準差定義為cutoff值,大于cutoff值判定為IgG抗體陽性。共檢出LASV IgG陽性1份,LUJV IgG陽性1份,DENV IgG陽性4份,YFV IgG陽性6份,其余病毒IgG抗體均未檢出。檢測結果如表1所示。

      2.4 ELISA檢測臨床血清樣本并與多重熒光微球檢測技術比較 將10種重組抗原分別包被ELISA板并檢測78份臨床血清和114份正常人血清樣本IgG抗體,以檢測正常人血清的平均值加3倍標準差定義為cutoff值(結果未顯示),并將ELISA檢測結果與多重熒光微球檢測結果做四格表卡方檢驗進行比較并做一致性分析,結果如表2所示,可知用兩種方法檢測血清樣本中10種IgG抗體的結果差異無統計學意義,且一致性較好。

      表1 多重熒光微球檢測臨床血清樣本出血熱病毒IgG抗體Tab.1 Detection of hemorrhagic fever virus IgG antibodies in clinical sera by multiplexed assay

      表2 多重熒光微球檢測方法與酶聯免疫吸附法檢測臨床血清的比較Tab.2 Comparison of Luminex multiplex assay and ELISA for clinical sera detection.

      3 討論

      本研究主要將Luminex高通量檢測方法應用于非洲流行的病毒性出血熱IgG抗體的多重檢測。該方法相比于傳統的ELISA方法在血清學檢測過程中最大的優(yōu)勢在于能夠實現高通量檢測,因此能夠大大節(jié)省檢測時間和樣本用量。以本實驗10重檢測為例,使用Luminex檢測方法的樣本用量為0.1 μl,2.5 h即可完成,而ELISA檢測方法需要10 μl樣本用量,至少需要6~8 h才能夠完成,并且ELISA抗原包被需要過夜,而Luminex的抗原偶聯只需要5 h[6]。除此之外,由于96孔ELISA板的底面積和側面積要比濾膜板每孔5 000個熒光微球的表面積之和大得多,從而增加非特異性的吸附并導致ELISA檢測結果的特異度降低。Luminex檢測方法的敏感性也要優(yōu)于ELISA方法,這是由于Luminex的熒光信號比酶的化學發(fā)光信號更加直接、穩(wěn)定和敏感,并且蛋白與微球之間以共價鍵相連,這比蛋白與ELISA板之間的疏水鍵更加穩(wěn)固、不易斷裂[7]。

      目前,國內外已建立起多種基于出血熱病毒核蛋白為檢測抗原的實驗室血清學檢測方法,如漢坦病毒(hantavirus),RVFV,發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV),LASV和EBOV等,并且都取得了很好的應用效果。這主要是因為核蛋白具有很強的抗原性和免疫原性,能夠刺激機體產生很強的特異性體液免疫應答和細胞免疫應答,從而生成大量的特異性抗體可供檢測。同時,核蛋白不具有糖基化位點,且本身作為病毒主要的結構蛋白,耐熱性和蛋白酶抗性較強,性質較為穩(wěn)定,適合重組表達、純化和保存,是病毒性出血熱血清學診斷的首選抗原。此外,對于YFV而言,包膜糖蛋白E的結構域Ⅲ(rEⅢ)具有較多的抗原位點,也常用于黃病毒血清學的檢測[8]。本研究中的DENV-rEⅢ是將登革病毒四個型的結構域Ⅲ串聯在一起而形成的融合抗原,該抗原具有更好的抗原性和免疫原性,可增加檢測的敏感度。

      本研究從非洲歸國的78例發(fā)熱病例中,共檢出1例LASV IgG抗體陽性,1例LUJV IgG抗體陽性,4例DENV IgG抗體陽性以及6例YFV IgG抗體陽性,并用ELISA方法進行了復核。雖然這些臨床病例均確診為瘧疾,但可以證明這些病患的既往感染史,從而間接反映出這些疾病在非洲的感染率情況。在今后的工作中,本課題組將繼續(xù)依托Luminex高通量檢測平臺,著重朝兩個方向發(fā)展:①利用IgG抗體的檢測經驗,建立病毒性出血熱IgM抗體以及抗原的多重檢測方法;②以不同的地域為劃分,建立針對流行于當地區(qū)域的病毒性出血熱多重檢測方法,例如在本研究所針對的非洲地區(qū)基礎之上,建立流行于南美的、歐洲的或者東南亞的病毒性出血熱多重檢測方法。

      綜上所述,本研究通過重組表達純化流行于非洲的出血熱病毒抗原,初步建立了基于Luminex高通量檢測平臺的針對非洲流行的病毒性出血熱IgG抗體多重檢測方法,為進一步驗證和完善該檢測方法,最終實現鑒別診斷奠定了基礎。

      利益沖突:無

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