徐玉玲， 王 姚， 張文靜， 楊 慧， 楊俊莉， 彭曉宇

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106)

0 引 言

川射干，為鳶尾科植物鳶尾的干燥根莖，有清熱解毒、消痰利咽的功效，主治咽喉腫痛、痰咳氣喘等癥[1].據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，川射干在臨床上具有神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤、抑菌等作用[2-5].研究表明，射干苷為川射干藥材的主要有效成分之一，具有抗炎、祛痰、抗病毒等藥效作用，可用作川射干藥材及其制品的質(zhì)量控制指標(biāo)[6].

目前，中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方法主要以化學(xué)有效成分含量為指標(biāo)，但有研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中用于含量測(cè)定的藥材細(xì)粉并不能完全代表藥材整體成分的真實(shí)數(shù)據(jù)[7].對(duì)此，劉濤等[8]提出用藥材真實(shí)含量結(jié)合有效成分臨床利用量來評(píng)價(jià)藥材的質(zhì)量.中藥成分臨床利用量，是指藥材成分在臨床應(yīng)用時(shí)，藥材中的化學(xué)成分可被臨床使用時(shí)利用的量，此質(zhì)量評(píng)價(jià)方法符合中醫(yī)藥臨床應(yīng)用特點(diǎn)，是體現(xiàn)中藥特色的一種中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法.基于此，本研究利用射干苷的臨床利用量對(duì)川射干藥材的質(zhì)量進(jìn)行再評(píng)價(jià)研究，擬為川射干及其他中藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)提供一種新思路.

1 儀器與材料

1.1 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：P-230Ⅱ型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)；BS-6KH型電子天平(上海友聲衡器有限公司)；FA-2004型分析電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；101-1-S型電熱鼓風(fēng)干燥箱(成都雅源科技有限公司)；KQ-100E型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；DL-1型電子萬用爐(北京永光明醫(yī)療儀器有限公司)；HH-6型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)；PHS-3C型精密PH計(jì)(上海日島科學(xué)儀器有限公司).

1.2 材 料

實(shí)驗(yàn)所用材料包括：川射干藥材(批號(hào)，170102、170108、170114、170123、170127、170206、170211、170221、170325、170331，簡(jiǎn)稱為S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10)，購(gòu)自四川逢春制藥有限公司，經(jīng)成都大學(xué)劉濤研究員鑒定為鳶尾科植物鳶尾的干燥根莖；射干苷對(duì)照品(批號(hào)，wkq16070103，HPLC≥98%)，購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司；甲醇為色譜純，水為怡寶純凈水，其余試劑均為分析純.

2 方法與結(jié)果

2.1 川射干中射干苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件.

實(shí)驗(yàn)的色譜條件為：色譜柱為Global Chromatography C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇—0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)(32∶68)；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm.

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備.

取射干苷對(duì)照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成124.8 μg/mL的對(duì)照品溶液.

2.1.3 供試品溶液的制備.

1)供試品溶液1.取本品粉末(過3號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理1 h，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL,置50 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得.

2)供試品溶液2.取本品未過3號(hào)篩藥材約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理1 h，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置50 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得.

3)供試品溶液3.取部分提取液于5 000 r/min下離心10 min，量取上層離心液2.5 mL于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得.

2.1.4 線性范圍.

分別精密量取射干苷對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，射干苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，Y=45451X+31.877，R=0.9990.結(jié)明表明，射干苷進(jìn)樣量在0.0624～0.3744 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好.

2.1.5 精密度.

精密吸取射干苷對(duì)照品10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積.結(jié)果顯示，RSD值為0.81%，表明儀器精密度良好.

2.1.6 重復(fù)性.

按“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液3制備供試品，平行6份，以“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定射干苷峰面積.結(jié)果顯示，RSD為2.55%，表明本方法重復(fù)性良好.

2.1.7 穩(wěn)定性.

按“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液3制備供試品，以“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別在供試品制備好后0、2、4、6、8、12、18、24 h進(jìn)樣測(cè)定射干苷峰面積.結(jié)果顯示，RSD為0.89%，表明在24 h內(nèi)供試品穩(wěn)定性良好.

2.2 川射干提取工藝優(yōu)選

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn).

取川射干50 g，平行2份，置于圓底燒瓶中，均加入10倍量水，分別在不浸泡[9]和浸泡至透心后，提取1 h，濾過，冷卻后測(cè)量體積.取部分提取液于5 000 r/min下離心10 min，量取上層離心液2.5 mL于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，測(cè)定射干苷含量，結(jié)果見表1.

表1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 正交試驗(yàn).

1)因素及水平的選擇.以水為提取溶媒，選取溶媒用量(A)、提取次數(shù)(B)與提取時(shí)間(C)為考察因素，以提取液中射干苷的量為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn).其因素水平表如表2所示.

表2 因素水平表

2)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果.分別取9組川射干藥材，每組100 g，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定提取液體積，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件及“2.2.1”項(xiàng)下步驟進(jìn)行含量測(cè)定，以川射干中射干苷的量與提取液中固含物(7∶3)為指標(biāo)，采用加權(quán)評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果如表3所示，方差分析如表4所示.

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

注：綜合評(píng)分=(射干苷量/最大射干苷量)×70+(固含物重/最大固含物重)×30

表4 方差分析表

由表4可得，水的用量(A)、提取次數(shù)(B)和提取時(shí)間(C)均對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有極顯著性影響，且影響大小依次為C>B>A.據(jù)此結(jié)果，選擇最佳提取工藝為A2B2C3，即用8倍量水，提取2次，每次2 h.

3)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).根據(jù)正交試驗(yàn)所得最佳提取工藝，以每份100 g川射干對(duì)其進(jìn)行3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得川射干射干苷的含量分別為323.93 mg、353.50 mg及283.82 mg，固含物的量分別為11.89736 g、11.21472 g、11.57785 g，以川射干中射干苷含量與提取液中固含物(7∶3)作為指標(biāo)計(jì)算RSD為1.61%.結(jié)果表明，正交試驗(yàn)所得最佳工藝穩(wěn)定可行.

2.3 不同批次川射干中射干苷真實(shí)含量及臨床利用量測(cè)定

2.3.1 不同批次川射干中射干苷真實(shí)含量測(cè)定.

按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品，以“2.1.1”中色譜條件分別測(cè)定10批川射干的真實(shí)含量(測(cè)定過3號(hào)篩的川射干粉末與未過的部分藥材的射干苷含量，然后根據(jù)兩部分的比例計(jì)算出川射干中射干苷的含量，即為藥材的真實(shí)含量)，結(jié)果如表5所示.

表5 不同批次川射干中射干苷真實(shí)含量測(cè)定結(jié)果

表5數(shù)據(jù)表明，川射干藥材真實(shí)含量最高的是第10批，真實(shí)含量為3.48%，最低的是第2批，其真實(shí)含量為1.23%；過篩粉末含量均高于其藥材真實(shí)含量.

2.3.2 不同批次川射干中射干苷臨床利用量測(cè)定.

分別取不同批次川射干藥材100 g，浸泡至透心，按最佳提取工藝提取，得提取液，冷卻后備用，取部分提取液于5 000 r/min下離心10 min，量取上層離心液2.5 mL于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻.測(cè)定川射干中射干苷含量以及臨床利用量，結(jié)果如表6所示.

表6 不同批次川射干中射干苷臨床利用量測(cè)定結(jié)果

注:臨床利用量=100 g×藥材真實(shí)含量×真實(shí)含量轉(zhuǎn)移率

表6數(shù)據(jù)表明，第10批川射干藥材臨床利用量最低，為152.076 mg/100 g；第4批川射干藥材臨床利用量最高，為422.823 mg/100 g.10批藥材真實(shí)含量差距不大，但由于其真實(shí)含量提取轉(zhuǎn)移率相差較大，使得10批藥材臨床利用量不同.

同時(shí)，本研究利用數(shù)據(jù)處理軟件“IBM SPSS statistics”中雙變量相關(guān)“pearson”對(duì)10個(gè)批次(S1～S10)的川射干按《中國(guó)藥典》測(cè)定含量和真實(shí)含量并與臨床利用量進(jìn)行相似度分析.經(jīng)計(jì)算，含量與真實(shí)含量和臨床利用量相關(guān)系數(shù)大小分別為-0.287(微弱負(fù)相關(guān))、-0.539(顯著負(fù)相關(guān)).

3 結(jié) 語

目前，臨床應(yīng)用上使用最廣泛的溶媒為水，為研究川射干的臨床利用量，本研究選取水作為提取溶媒.射干苷屬異黃酮類，其水溶性差[10]，難以在水中完全溶解，因此，其提取轉(zhuǎn)移率較低，但提取轉(zhuǎn)移率低也可能與藥材炮制方式有關(guān).

《中國(guó)藥典》2015版四部關(guān)于藥材與飲片定量檢測(cè)項(xiàng)中均規(guī)定過篩，并取過篩后粉末以其中某一化學(xué)成分量為指標(biāo)進(jìn)行定量測(cè)定來判斷藥材是否合格.研究發(fā)現(xiàn)，取通過不同藥篩的細(xì)粉測(cè)定，其成分含量有一定變化[11]，而未過篩的藥材與過篩后的藥粉指標(biāo)成分量相差較大，如梔子和木蝴蝶[7].則取過篩后的細(xì)粉進(jìn)行定量測(cè)定所得的結(jié)果并不能完全代表藥材整體成分的真實(shí)量，故本研究按文獻(xiàn)[8]中的方法測(cè)定真實(shí)含量來代表藥材整體成分的含量.通常，藥材的含量測(cè)定是采用有機(jī)溶劑把藥材中的化學(xué)成分提取出來加以測(cè)定的，臨床利用量是采用水作為溶媒將化學(xué)成分提取出來并測(cè)定的.由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，由于提取溶媒的極性差異導(dǎo)致川射干中射干苷的臨床利用量多少與藥材中射干苷含量及真實(shí)含量高低呈負(fù)相關(guān)，而臨床利用量是表征藥物中化學(xué)成分在被患者服用時(shí)藥材可被利用的量，更能體現(xiàn)藥物臨床價(jià)值，對(duì)該值的研究和測(cè)定可為中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)提供一種新思路.