果膠裂解酶基因與木聚糖酶基因的共表達(dá)

宋立立， 頓寶慶， 張亞楠， 張兆英

(1.滄州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北滄州 061000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院作物科學(xué)研究所/國(guó)家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程/生物質(zhì)能源研究中心，北京 100081

在釀酒行業(yè)中，作為原料的糧食外層有纖維素和木聚糖等半纖維素成分，從而影響對(duì)淀粉的利用率。利用木聚糖酶作用于半纖維素層，降低物料黏度，有利于提高淀粉的利用率，增加乙醇的產(chǎn)率[1]。木聚糖酶通過(guò)水解木糖分子1，4-糖苷鍵，將木聚糖水解為木寡糖等低木聚糖及少量木糖和阿拉伯糖，在食品、飼料、醫(yī)藥、能源、生物轉(zhuǎn)化等行業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用[2-4]。果膠酶是可將果膠協(xié)同分解為半乳糖醛酸等小分子的一組酶的總稱(chēng)，存在于高等植物及微生物中，也分布在某些昆蟲(chóng)和原生動(dòng)物中。根據(jù)果膠酶作用原理分為原果膠酶、果膠酯酶、水解酶、裂解酶[5]，其中水解酶和裂解酶統(tǒng)稱(chēng)解聚酶。果膠裂解酶在果酒的澄清和提高出酒率方面起著重要作用[6]。

近年來(lái)，蛋白融合技術(shù)越來(lái)越受到人們的關(guān)注，其中基因重疊延伸技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，通過(guò)重疊PCR方法將木聚糖酶基因和果膠裂解酶基因連接在一起，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21原核系統(tǒng)中，實(shí)現(xiàn)了木聚糖酶-果膠裂解酶雙功能酶的分泌表達(dá)，為工業(yè)化應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

海棲熱袍桿菌購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物菌種保藏中心；木聚糖酶基因來(lái)源菌桔青霉CR-2由筆者所在實(shí)驗(yàn)室篩選得到；pPAL7表達(dá)載體購(gòu)自BIO-RAD(美國(guó))公司；表達(dá)菌株BL21和克隆宿主菌EscherichiacoliDH5α由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶均購(gòu)自NEB(北京)有限公司；PGEM-Teasy購(gòu)自Promega(北京)生物技術(shù)有限公司；DNA回收試劑盒和DNA純化試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；氨芐青霉素購(gòu)自Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。試驗(yàn)涉及引物見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)涉及引物

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 LB培養(yǎng)基配制方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[7]。

1.2.2 目的基因片段的克隆 用P1和P2、P3和P4分別對(duì)2個(gè)基因做PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的片段電泳檢測(cè)，條帶正確的1組將2個(gè)基因PCR組分混合，用兩端引物P1和P4做融合PCR擴(kuò)增，最終得到融合基因序列，擴(kuò)增物理圖譜如圖1所示。

1.2.3 質(zhì)粒提取方法 質(zhì)粒提取方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.4 大腸桿菌轉(zhuǎn)化DH5α采用熱擊轉(zhuǎn)化方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[7]進(jìn)行操作。

1.2.5 表達(dá)載體質(zhì)粒DNA酶切鑒定 酶切反應(yīng)體系(μL)：Plasmid DNA 2 μL，10×enzyme buffer 5 μL，NdeⅠ 0.5 μL，EcoRⅠ 0.5 μL，補(bǔ)充ddH2O至20 μL，37 ℃過(guò)夜酶切，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.6 目的片度和載體連接 目的片度和pGEM-T easy連接體系：目的片段4 μL，pGEM-T easy 0.5 μL，2×buffer 5 μL，Ligese 0.5 μL，總體積10 μL，漩渦混勻離心機(jī)點(diǎn)離，4 ℃ 過(guò)夜連接。

1.2.7 大腸桿菌DH5α、BL21的制備 制備方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[7]進(jìn)行操作。

1.2.8 融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建 pPAL7表達(dá)載體構(gòu)建方法詳見(jiàn)圖2。

1.2.9 大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn) 挑選驗(yàn)證正確的單菌落，接入10 mL含100 mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)至D600 nm為0.2～0.6；取100 μL樣品加入50 mL含 100 mg/mL 氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)至D600 nm為0.2～0.6，加入終濃度達(dá)到0.8 mmol/L 的IPTG，37 ℃培養(yǎng)，每 2 h 取樣；樣品超生波破碎后測(cè)定其酶活性，分析表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 融合基因的PCR擴(kuò)增

將來(lái)源于海棲熱袍桿菌的果膠裂解酶基因和來(lái)源于桔青霉CR-2的木聚糖酶基因分別做PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化后等體積混勻，用兩端的引物(P1和P4)做PCR擴(kuò)增得到融合基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定，在 1 737 bp 處有1條明顯的條帶，與2個(gè)基因的總長(zhǎng)度相同(圖3)。回收PCR產(chǎn)物連接PGEM-T easy測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，該基因序列中含有果膠裂解酶基因和木聚糖酶基因，提取重組子的質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證后得到2條條帶：一條帶為 1 737 bp，與PCR產(chǎn)物帶相同；另一條帶為3 000 bp，與載體pEGM-T easy的條帶大小一致(圖4)，結(jié)果表明融合基因插入載體的位置正確。

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

雙酶切后回收載體大片段與目的基因連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到的重組子提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切結(jié)果表明，該重組子中含有該融合基因(圖5)。將該重組子轉(zhuǎn)入受體菌株BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)。

2.3 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)

將含有融合基因的重組子進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)，間隔時(shí)間取樣，采用DNS法[8]測(cè)定其酶活性。果膠裂解酶和木聚糖酶的活性均在誘導(dǎo)6 h時(shí)達(dá)到最高，分別為30.11 U/mL、2.03 IU/mL(圖6、圖7)。

3 結(jié)論

將來(lái)源于海棲熱袍桿菌的果膠裂解酶基因和來(lái)源于桔青酶的木聚糖酶基因構(gòu)建融合基因，轉(zhuǎn)化受體菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，2個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)了在大腸桿菌中的共表達(dá)。本研究所構(gòu)建的基因工程菌所產(chǎn)的木聚糖酶的反應(yīng)溫度為50 ℃，pH值為中性，有比較穩(wěn)定的活性，誘導(dǎo)6 h時(shí)酶活性能達(dá)到最高，為2.03 IU/mL；果膠裂解酶基因在誘導(dǎo)6 h后酶活性最高達(dá)到30.11 U/mL。

本研究果膠裂解酶基因和木聚糖酶基因均比其他文獻(xiàn)中單個(gè)基因的表達(dá)量低，其原因可在今后的工作中繼續(xù)研究。