張錚錚，劉 筱，徐 浩，魏 敏，杜文升，陸曉媛

(徐州醫(yī)科大學(xué) 1. 附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科、2. 婦產(chǎn)科教研室、3. 附屬醫(yī)院急救中心，江蘇 徐州 221002)

目前，子宮內(nèi)膜癌多采用手術(shù)與化療相結(jié)合的綜合治療方法。然而，化療藥物多存在毒性大、副作用強(qiáng)的缺點(diǎn)，且長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生耐藥性[1-2]。因此，進(jìn)一步尋找新的高效、低毒化療藥物仍是一個(gè)非常有意義的臨床熱點(diǎn)問(wèn)題[3]。

骨化三醇(calcitriol)又稱(chēng)1，25-(OH)2D3，是維生素D3的重要活性代謝產(chǎn)物之一。通過(guò)激活特異維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[4]。有研究報(bào)道，骨化三醇與VDR結(jié)合，引起其構(gòu)象變化和磷酸化，同時(shí)可激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路[5]。而該通路作為細(xì)胞內(nèi)非常重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、增殖、凋亡、血管生成、自噬等過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。該通路的紊亂可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、化療耐藥等[6]。雷帕霉素(rapamycin)及其衍生物是mTOR信號(hào)特異性的抑制劑。Grabiner等[7]證實(shí)，抑制mTOR通路可以有效阻斷各種生長(zhǎng)因子異常信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制癌細(xì)胞的發(fā)生與生長(zhǎng)。但骨化三醇、 雷帕霉素及其二者聯(lián)合使用對(duì)子宮內(nèi)膜癌的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬通過(guò)觀察骨化三醇、雷帕霉素及其聯(lián)合使用對(duì)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株形態(tài)、增殖周期及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)表達(dá)的影響，以期明確其抑癌效應(yīng)及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株與試劑 子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株，購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。骨化三醇、雷帕霉素均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Akt、mTOR引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成；抗mTOR(SC-8319)、Akt(SC-24500)抗體，均購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology；羊抗兔IgG(H+L)、DylightTM680偶聯(lián)的二抗，購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；驢抗羊IgG(H+L)(IRDye800CW)，購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.1.2儀器 二氧化碳孵育箱(美國(guó)Thermo公司)；WFH-204B型手提式紫外分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；倒置相差顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)(Motic AE 31);Centrifuge 5810R冷凍超速離心機(jī)、Mastercycler Gradient PCR反應(yīng)儀(德國(guó)Eppendorf公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)ESPELITE公司)；GDS-800數(shù)碼凝膠攝影系統(tǒng)(英國(guó)UVP公司)。

1.2方法

1.2.1骨化三醇和雷帕霉素抑癌適宜濃度和時(shí)間點(diǎn)的篩選 骨化三醇(10-6、10-7、10-8、10-9mol·L-1)及雷帕霉素(100.0、50.0、25.0、12.5 nmol·L-1)分別與人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株共培養(yǎng)24、48、72 h，同時(shí)設(shè)立不加藥物的溶媒對(duì)照。MTT法測(cè)定不同濃度骨化三醇對(duì)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株增殖的抑制率，抑制率=(1-用藥組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。以抑制率最高所需較低濃度、較短時(shí)間作為適宜濃度和時(shí)間點(diǎn)。將抑制率最高且濃度較低的骨化三醇和雷帕霉素混合液作為聯(lián)合抑癌的適宜濃度，與人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株共培養(yǎng)24、48、72 h，藥物合用效果用金氏公式p2推測(cè)[8]：q=E(AB)/[EA+(1-EA)×EB]，其中E(AB)為兩藥合用的抑制率，EA和EB為各藥單用時(shí)的抑制率。q=0.85～1.15表示兩藥作用相加；q>1.5表示兩藥作用協(xié)同；q<0.85表示兩藥作用拮抗，進(jìn)一步篩選出適宜時(shí)間。

1.2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 用倒置顯微鏡觀測(cè)骨化三醇、雷帕霉素及其聯(lián)合使用對(duì)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株形態(tài)學(xué)的影響。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 實(shí)驗(yàn)分為骨化三醇組(10-7mol·L-1)、雷帕霉素組(50 nmol·L-1)、聯(lián)合組(骨化三醇10-7mol·L-1+雷帕霉素50 nmol·L-1)、溶媒對(duì)照組。收集不同藥物作用48 h后的細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，按照細(xì)胞周期試劑盒說(shuō)明，2 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。細(xì)胞濃度1×109·L-1，取1 mL單細(xì)胞懸液離心后，4℃保存，染色前用PBS洗去固定液；加入100 μL RNase A 37℃水浴30 min；再加入400 μL PI染色混勻，4℃避光30 min；上機(jī)檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處紅色熒光。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖周期的影響。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá) 參考試劑盒說(shuō)明，提取Ishikawa細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。擴(kuò)增樣本體系為25 μL。擴(kuò)增條件均為：94℃預(yù)變性30 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 1 min，72℃ 5 min終止。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算Akt、mTOR mRNA的相對(duì)表達(dá)量。Akt上游引物：5′-ACGGGCACATTAAGATCACAG-3′，下游引物：5′-GGCTGAGCTTCTTCTCGTACA-3′；mTOR上游引物：5′-CTGGGACTCAAATGTGTGCAGTTC-3′，下游引物5′-GAACAATAGGGTGAATGATCCGGG-3′；內(nèi)參基因β-actin 上游引物：5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACG-3′，下游引物：5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG -3′。

1.2.5Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá) 將實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞按前述方式分組培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品加樣，SDS-PAGE電泳，將蛋白條帶轉(zhuǎn)到PVDF膜上，250 mA電流轉(zhuǎn)膜30 min，5%脫脂牛奶封閉3 h，4℃孵育一抗過(guò)夜，回收、漂洗一抗，然后室溫下孵育二抗2 h，洗滌后加入顯色液，分析各組Akt、mTOR蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1骨化三醇、雷帕霉素以及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖的影響

2.1.1骨化三醇對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖的影響 Fig 1A的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相同濃度的骨化三醇，隨作用時(shí)間增加而抑制率上升，似具有時(shí)間依賴(lài)性。在0～48 h時(shí)間范圍內(nèi)，抑制率曲線(xiàn)的斜率較大，表明其抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖作用明顯，而隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，在48～72 h時(shí)間范圍內(nèi)，該曲線(xiàn)的斜率明顯減小，曲度趨向平坦，表明其抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖作用變化不大。10-7mol·L-1的骨化三醇作用于Ishikawa細(xì)胞株48 h的抑制率為(51.82±2.03)%，72 h抑制率為(52.35±3.22)%，均高于其他實(shí)驗(yàn)濃度組。而10-7mol·L-1骨化三醇在48 h和72 h的抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，骨化三醇作用于Ishikawa細(xì)胞的最佳濃度為10-7mol·L-1。作用時(shí)間方面，雖然72 h的抑制率高于48 h，但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從藥物毒性時(shí)間依賴(lài)性的角度，本實(shí)驗(yàn)選用48 h為最佳作用時(shí)間點(diǎn)。

2.1.2雷帕霉素對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖的影響 Fig 1B實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相同濃度的雷帕霉素，隨作用時(shí)間增加而抑制率上升，似具有時(shí)間依賴(lài)性。在0～48 h時(shí)間范圍內(nèi)，抑制率曲線(xiàn)的斜率較大，表明其抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖作用明顯，而隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，在48～72 h時(shí)間范圍內(nèi)，該曲線(xiàn)的斜率明顯減小，曲度趨向平坦，表明其抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖作用變化不大。100.0 nmol·L-1的雷帕霉素作用于Ishikawa細(xì)胞株48 h的抑制率為(46.22±2.62)%，72 h抑制率為(47.26±3.63)%，均高于其他實(shí)驗(yàn)濃度組。但與50.0 nmol·L-1雷帕霉素組相比，在48 h和72 h時(shí)間點(diǎn)抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，雷帕霉素作用于Ishikawa細(xì)胞的最佳濃度為50.0 nmol·L-1，最佳作用時(shí)間點(diǎn)為48 h。

2.1.3骨化三醇聯(lián)合雷帕霉素對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖的影響 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將溶媒對(duì)照組、10-7mol·L-1骨化三醇組、50 nmol·L-1雷帕霉素組、聯(lián)合用藥組(10-7mol·L-1骨化三醇+50 nmol·L-1雷帕霉素)分別與Ishikawa細(xì)胞株共培養(yǎng)48 h。Fig 1C結(jié)果表明，骨化三醇聯(lián)合雷帕霉素對(duì)Ishikawa細(xì)胞抑制率為(63.64±2.05)%，均高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用金氏公式評(píng)價(jià)骨化三醇聯(lián)合雷帕霉素的應(yīng)用效果，q值為1.53，表明骨化三醇、雷帕霉素聯(lián)合用藥療效優(yōu)于單獨(dú)用藥，為增強(qiáng)效應(yīng)。

Fig 1 Effect of calcitriol, rapamycin and combination treatment on proliferation of human endometrial carcinoma Ishikawa cells in vitro n=6)

A: The inhibitory rate of calcitriol on Ishikawa cells; B: The inhibitory rate of rapamycin on Ishikawa cells.*P<0.05vs24 h; C: The inhibitory rate of calcitriol and rapamycin on Ishikawa cells.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscalcitriol and rapamycin combined group.

2.2骨化三醇、雷帕霉素及其聯(lián)合使用對(duì)Ishikawa細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響將骨化三醇(10-7mol·L-1)、雷帕霉素(50 nmol·L-1)以及骨化三醇聯(lián)合雷帕霉素分別與Ishikawa細(xì)胞培養(yǎng)48 h。如Fig 2所示，溶媒對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，光鏡視野內(nèi)貼壁細(xì)胞密集，胞體飽滿(mǎn)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，透明，表面光滑，折光性好，細(xì)胞增殖旺盛。骨化三醇組和雷帕霉素組細(xì)胞則出現(xiàn)視野內(nèi)細(xì)胞密度減低，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變圓、縮小、邊界清晰，核內(nèi)顆粒增多，折光性差，邊緣不整，部分懸浮于培養(yǎng)液中；而骨化三醇聯(lián)合雷帕霉素組細(xì)胞密度進(jìn)一步減小，部分細(xì)胞已解體，見(jiàn)較多的凋亡和壞死細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中。

Fig 2 Number of survival cells under an inverted phase microscope cultured for 48 h(scale bar=100 μm)

A:Control; B：Calcitriol; C：Rapamycin; D：Combination.

2.3骨化三醇、雷帕霉素及其聯(lián)合使用對(duì)Ishikawa細(xì)胞周期的影響如Fig 3所示，與溶媒對(duì)照組相比，骨化三醇組、雷帕霉素組在G1峰前均出現(xiàn)較低二倍體細(xì)胞凋亡峰，聯(lián)合用藥組則在G1峰前出現(xiàn)較高二倍體細(xì)胞凋亡峰。Tab 1結(jié)果表明，骨化三醇組和雷帕霉素組G0/G1期細(xì)胞所占比例均高于溶媒對(duì)照組，而S期和G2/M期細(xì)胞所占的比例最低；骨化三醇聯(lián)合雷帕霉素組的凋亡率高于其各自單獨(dú)用藥組(P<0.05)；溶媒對(duì)照組細(xì)胞大多處于G0/G1期，S期次之，G2/M期最少。骨化三醇或雷帕霉素能使細(xì)胞周期發(fā)生變化，G0/G1期細(xì)胞增加，S期、G2/M期比例稍減少，而聯(lián)合用藥G0/G1期細(xì)胞增加更明顯，S期、G2/M期細(xì)胞比例相應(yīng)減少，凋亡率明顯增加。

Fig 3 Cell cycle of human endometrial carcinoma Ishikawa cells performed by flow cytometry

A:Control; B：Calcitriol; C：Rapamycin; D：Combination.

Tab 1 Apoptotic rate and percentage of cells during each stage to total cell n=6)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vscombination

2.4骨化三醇、雷帕霉素及其聯(lián)合使用對(duì)Ishikawa細(xì)胞Akt、mTORmRNA表達(dá)的影響Fig 4的RT-PCR結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，骨化三醇組、雷帕霉素組及骨化三醇聯(lián)合雷帕霉素組Ishikawa細(xì)胞內(nèi)Akt、mTOR mRNA的表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，骨化三醇聯(lián)合雷帕霉素組表達(dá)水平最低，與其他組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5骨化三醇、雷帕霉素及其聯(lián)合使用對(duì)Ishikawa細(xì)胞Akt、mTOR蛋白表達(dá)的影響Fig 5的Western blot結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，骨化三醇組、雷帕霉素組及骨化三醇聯(lián)合雷帕霉素組Ishikawa細(xì)胞Akt、mTOR蛋白的表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，骨化三醇聯(lián)合雷帕霉素組表達(dá)量最低，與其他組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 4 Expression of Akt and mTOR mRNA in Ishikawa cells cultured for 48 h n=6)

1：Control;2:Calcitriol; 3：Rapamycin; 4：Calcitriol+Rapamycin.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscombination group

Fig 5 Expression of Akt and mTOR proteins in Ishikawa cells

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscombination group

3 討論

適宜的藥物濃度和作用時(shí)間對(duì)藥物的生物學(xué)效應(yīng)至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)采用10-6～10-9mol·L-1的骨化三醇和12.5～100.0 nmol·L-1的雷帕霉素分別與Ishikawa細(xì)胞共培養(yǎng)24～72 h，MTT法觀察比較兩種藥物對(duì)癌細(xì)胞的抑制率，以期尋找適宜的藥物濃度和作用時(shí)間。盡管結(jié)果表明兩種藥物對(duì)癌細(xì)胞的抑制率均具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性，但并非呈直線(xiàn)關(guān)系。根據(jù)抑癌效果曲線(xiàn)圖，可見(jiàn)至一定濃度和時(shí)間點(diǎn)，曲線(xiàn)由直線(xiàn)趨轉(zhuǎn)平緩。鑒于既往資料報(bào)道，藥物濃度越高伴隨而來(lái)的副作用風(fēng)險(xiǎn)愈大；藥物作用時(shí)間越長(zhǎng)，常致細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)需求量增加、代謝產(chǎn)物增加，細(xì)胞生長(zhǎng)空間受限，造成缺氧、凋亡等負(fù)效應(yīng)等理由[10]，我們選擇抑制效果相近，而濃度更小的10-7mol·L-1骨化三醇和50.0 nmol·L-1雷帕霉素作為適宜濃度。以48 h作為藥物作用的適宜時(shí)間。

我們進(jìn)一步以上述適宜濃度和時(shí)間比較骨化三醇、雷帕霉素以及二者聯(lián)合用藥的抑癌效果。單獨(dú)和聯(lián)合使用骨化三醇與雷帕霉素，均有不同程度的抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞作用，但聯(lián)合用藥的抑制效率更高。根據(jù)藥物合用效果金氏公式測(cè)算，q=1.53，表明骨化三醇與雷帕霉素聯(lián)合使用，對(duì)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞抑制作用的合用效果為協(xié)同作用。

聯(lián)合用藥對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)在進(jìn)一步的形態(tài)學(xué)研究中同樣得到證實(shí)。倒置顯微鏡觀察顯示，單獨(dú)使用骨化三醇和雷帕霉素，細(xì)胞密度較對(duì)照組降低，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變圓、縮小，核內(nèi)顆粒增多，凋亡細(xì)胞增多，折光性差，邊緣不整，部分懸浮于培養(yǎng)液中；而聯(lián)合應(yīng)藥后可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少，部分細(xì)胞已解體，見(jiàn)較多的凋亡和壞死細(xì)胞。

細(xì)胞增殖是一個(gè)連續(xù)而又受調(diào)節(jié)的過(guò)程，增殖周期可分為G0/G1期、S期、G2期和M期。檢測(cè)上述幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的增殖狀態(tài)可反映骨化三醇、雷帕霉素及其聯(lián)合應(yīng)用對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的影響狀況。結(jié)果表明，骨化三醇和雷帕霉素單獨(dú)及聯(lián)合使用，均可使細(xì)胞周期發(fā)生變化，G0/G1期細(xì)胞增加，S期、G2/M期比例稍減少；單獨(dú)使用在G1前即可出現(xiàn)較低的二倍體峰細(xì)胞凋亡圖像，聯(lián)合用藥組可見(jiàn)G1峰前出現(xiàn)的較高二倍體峰細(xì)胞凋亡圖，提示凋亡率明顯增加。這一結(jié)果從抑制細(xì)胞周期增殖角度進(jìn)一步為聯(lián)合用藥的協(xié)同作用提供了佐證。

雷帕霉素是最早被發(fā)現(xiàn)的mTOR抑制劑。有研究表明，mTOR信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并與腫瘤的血管生成、轉(zhuǎn)移及化療耐藥有關(guān)[11]。雷帕霉素能結(jié)合FKBP(FK506結(jié)合蛋白)，抑制mTOR，阻止P70S6K和4EBP磷酸化，同時(shí)也間接抑制了其它相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯，具有抗菌、免疫抑制和抗腫瘤作用[12]。早在20世紀(jì)70年代，人們就發(fā)現(xiàn)了雷帕霉素具有抗腫瘤活性。在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生機(jī)制研究中，Dedes等[13]認(rèn)為，PI3k/Akt/mTOR是最容易出現(xiàn)異常激活的信號(hào)通路。作為PI3K/Akt通路的下游分子mTOR，為細(xì)胞啟動(dòng)翻譯信號(hào)及細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期所必需，是細(xì)胞分解和合成代謝的調(diào)節(jié)中心，與蛋白合成、細(xì)胞周期的調(diào)控相關(guān)[14]。在許多腫瘤組織培養(yǎng)和動(dòng)物模型中，mTOR的選擇性抑制劑雷帕霉素對(duì)乳腺癌、白血病、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、黑色素瘤、小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤均具有濃度依賴(lài)性的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性[15]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步使用RT-PCR、Western blot，觀察了骨化三醇、雷帕霉素及聯(lián)合用藥組對(duì)Ishikawa細(xì)胞中Akt、mTOR mRNA及蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明，單獨(dú)使用骨化三醇和雷帕霉素，Ishikawa細(xì)胞的Akt、mTOR mRNA及蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均有下降，但聯(lián)合用藥組下降更明顯。由此推測(cè)，骨化三醇、雷帕霉素及其聯(lián)合應(yīng)用均可能通過(guò)影響PI3k/Akt/mTOR通路，下調(diào)Akt、mTOR的mRNA及蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞增殖周期，加速細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑制癌細(xì)胞作用。

我們的研究從細(xì)胞增殖抑制率、形態(tài)學(xué)、細(xì)胞增殖周期等多個(gè)層面，為骨化三醇、雷帕霉素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞協(xié)同抑制效應(yīng)提供了科學(xué)的依據(jù)，并初步揭示了其發(fā)揮作用的可能機(jī)制，也為臨床各領(lǐng)域骨化三醇、雷帕霉素及其聯(lián)合使用提供了有益的參考。