王衛(wèi)秦，袁奎超

(1.河南新鄉(xiāng)衛(wèi)輝市畜牧局，河南 衛(wèi)輝 453100；2.河南省新蔡縣畜牧局，河南 新蔡 463500)

抗生素被用做畜禽生長(zhǎng)促進(jìn)劑曾經(jīng)發(fā)揮了非常重要的作用，很大程度上促進(jìn)了畜牧業(yè)的發(fā)展[1]。但是，由于抗生素的過(guò)度使用，動(dòng)物體和環(huán)境中細(xì)菌、霉菌等病原微生物耐藥性逐漸增強(qiáng)，其對(duì)畜禽的生長(zhǎng)促進(jìn)作用逐步下降，同時(shí)畜禽體內(nèi)過(guò)多抗生素殘留物也對(duì)人類(lèi)健康造成了嚴(yán)重威脅[2]。近年來(lái)，隨著生活水平的提高，人們對(duì)食品安全問(wèn)題的關(guān)注度越來(lái)越高。目前，包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家正在考慮禁止動(dòng)物飼料中添加抗生素。尋求綠色、高效、天然的抗生素替代品，已成為畜牧業(yè)研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。

作為抗生素的替代品之一，殼聚糖(chitosan)是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物。甲殼素為可再生的天然資源，自然界中存在的唯一帶陽(yáng)離子的天然活性多糖就是殼聚糖,它可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、畜牧及環(huán)保等領(lǐng)域。殼聚糖的功能與其分子質(zhì)量大小關(guān)系密切,可降解成低聚糖和殼寡糖,發(fā)揮出免疫調(diào)節(jié)、抑菌、抗腫瘤等功能。

銅不僅參與造血和鐵的代謝，而且構(gòu)成許多含銅酶及含銅生物活性蛋白，與維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)，是動(dòng)物體內(nèi)必需的微量元素[3]。高銅作為促生長(zhǎng)劑可以促進(jìn)畜禽的采食量、改善腸道健康、減少體內(nèi)有害微生物[4]。但過(guò)度使用無(wú)機(jī)銅(主要為硫酸銅)不僅造成資源的浪費(fèi)和環(huán)境污染問(wèn)題的產(chǎn)生，還在一定程度上破壞其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。研究表明，有機(jī)銅的穩(wěn)定性更好，不僅可以降低與礦物質(zhì)元素間的拮抗作用，而且減少了對(duì)其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞[5]；有機(jī)銅的溶解度高，容易被小腸黏膜吸收，使銅資源更有效地被利用；同時(shí)有機(jī)銅的單位促生長(zhǎng)效果更為明顯，可有效替代無(wú)機(jī)銅的作用。

早期斷奶仔豬，消化酶系的發(fā)育尚不健全，內(nèi)源消化酶活性低，消化系統(tǒng)形態(tài)結(jié)構(gòu)變化明顯，阻礙了斷奶仔豬正常的生長(zhǎng)發(fā)育。仔豬腸道微生態(tài)區(qū)系極不穩(wěn)定，且因?yàn)閿嗄桃鸬膽?yīng)激反應(yīng)，嚴(yán)重影響了腸道內(nèi)正常菌群的建立。有研究表明，殼聚糖對(duì)空腸與盲腸兩個(gè)部位的調(diào)節(jié)作用更為明顯[6]。然而，目前有關(guān)殼聚糖在生產(chǎn)中的研究主要集中在簡(jiǎn)單粉碎產(chǎn)物上，有關(guān)二次加工物研究較少。本研究以膨化處理后的殼聚糖微粒與銅的絡(luò)合物作為試驗(yàn)材料，旨在探討殼聚糖對(duì)仔豬菌群影響的機(jī)理，篩選膨化殼聚糖銅作為仔豬飼料添加劑的最適添加量，為開(kāi)發(fā)綠色、環(huán)保型仔豬飼料添加劑提供理論與實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

膨化殼聚糖銅(河南科技學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)組提供)、M肉湯培養(yǎng)基、RS培養(yǎng)基、伊紅美蘭(EMB)、志賀氏-沙門(mén)氏瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

28日齡杜×長(zhǎng)×大外三元雜交斷奶仔豬96頭(購(gòu)于河南誼發(fā)牧業(yè))。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及日糧組成

試驗(yàn)選取96頭28日齡斷奶仔豬(杜×長(zhǎng)×大)，隨機(jī)分為4個(gè)日糧處理組(設(shè)3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組)，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8頭，公母各半。試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧里分別添加0.01%、0.02%、0.04%含量的膨化殼聚糖銅，預(yù)試期7 d，正試期為40 d。本試驗(yàn)在河南省誼發(fā)牧業(yè)有限公司進(jìn)行，試驗(yàn)舍為仔豬保育舍，試驗(yàn)期間仔豬自由采食、飲水，豬場(chǎng)按常規(guī)免疫程序免疫，舍內(nèi)平均溫度20～25 ℃。

表1 試驗(yàn)分組

供試驗(yàn)用基礎(chǔ)日糧按照NRC(2012)豬營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制[7]，其原料組成與營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。其中預(yù)混料含有的微量元素與維生素的含量分別為：Cu 10 mg/kg、Fe 80 mg/kg、Mn 30 mg/kg、Zn 80 mg/kg、I 0.5 mg/kg、Se 0.3 mg/kg、VA 5 000 IU/kg、VD3200 IU/kg、VE 20 IU/kg、VK31.30 mg/kg、VB14 mg/kg、VB24 mg/kg、 VB62 mg/kg、VB1220 mg/kg、泛酸18 mg/kg、煙酸 26 mg/kg、膽堿 56 mg/kg。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

腸道揮發(fā)性脂肪酸VFA測(cè)定(毛細(xì)管氣相色譜法)、乳酸桿菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌、擬桿菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、摩氏變形菌(平板培養(yǎng))細(xì)菌計(jì)數(shù)[8]。

表2 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.5 糞便菌群的測(cè)定

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，選取對(duì)照組和各試驗(yàn)組豬進(jìn)行屠宰，每組屠宰4頭豬，在每頭豬相同部位取回腸、結(jié)腸和盲腸內(nèi)容物約2g，按光岡氏腸內(nèi)菌群法進(jìn)行操作[9]。在超凈工作臺(tái)中取結(jié)腸、盲腸、直腸內(nèi)容物各0.5g，放入無(wú)菌試管中，加入無(wú)菌PBS稀釋液4.5mL，震蕩5min，此液為10-1稀釋液，按此方法依次進(jìn)行10-3～10-6倍稀釋。取不同腸段、不同濃度的稀釋液0.1mL涂于鑒定培養(yǎng)基上。擬桿菌、乳酸桿菌、芽孢桿菌、雙歧桿菌接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48h，平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)菌落。大腸桿菌、摩氏變形菌、沙門(mén)氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌分別在伊紅美蘭、志賀氏-沙門(mén)氏瓊脂培養(yǎng)基及肉湯培養(yǎng)基中37℃有氧培養(yǎng)24h，然后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[10]。根據(jù)菌群細(xì)胞形態(tài)、甲基紅(M.R)試驗(yàn)、產(chǎn)吲哚試驗(yàn)、革蘭氏染色法等方法來(lái)鑒定這幾種細(xì)菌[11]。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 膨化殼聚糖銅對(duì)斷奶仔豬盲腸微生物的影響

見(jiàn)表3。

表3 膨化殼聚糖銅對(duì)仔豬盲腸微生物(×105 CFU/g)的影響

注：字母相同者差異不顯著(P>0.05)，字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下同

由表3可知：盲腸段0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，乳酸桿菌分別提高了48.89%(P<0.05)、34.42%(P<0.05)，其0.04%試驗(yàn)組和0.02%試驗(yàn)組相比差異不顯著(P>0.05)。0.04%試驗(yàn)組、0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，雙歧桿菌分別提高了34.83%(P<0.05)、24.48%(P<0.05)、15.92%(P>0.05)。0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，芽孢桿菌分別提高了39.44%(P<0.05)、17.77%(P<0.05)，0.04%試驗(yàn)組和0.02%試驗(yàn)組相比差異不顯著(P>0.05)。擬桿菌各組試驗(yàn)結(jié)果差異不顯著(P>0.05)。0.04%試驗(yàn)組、0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，大腸桿菌分別降低了47.39%(P<0.05)、36.36%(P<0.05)、18.49%(P<0.05)。0.04%試驗(yàn)組、0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，沙門(mén)氏菌分別降低了41.7%(P<0.05)、28.51%(P<0.05)和15.11%(P<0.05)。0.04%試驗(yàn)組、0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，產(chǎn)氣莢膜梭菌分別降低了38.26%(P<0.05)、24.4%(P<0.05)、12.44%(P<0.05)。摩氏變形菌各組試驗(yàn)結(jié)果差異不顯著(P>0.05)。

2.2 膨化殼聚糖銅對(duì)斷奶仔豬結(jié)腸微生物的影響

見(jiàn)表4。

表4 膨化殼聚糖銅對(duì)仔豬結(jié)腸微生物(×105 CFU/g)的影響

由表4可知：結(jié)腸段0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，乳酸桿菌分別提高了55.71%(P<0.05)、36.60%(P<0.05)，其0.04%試驗(yàn)組和0.02%試驗(yàn)組相比差異不顯著(P>0.05)。0.04%試驗(yàn)組、0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，雙歧桿菌分別提高了50.74%(P<0.05)、38.12%(P<0.05)、42.93%(P>0.05)。0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，芽孢桿菌分別提高了42.93(P<0.05)、24.15%(P<0.05)，其0.04%試驗(yàn)組和0.02%試驗(yàn)組相比差異不顯著(P>0.05)。擬桿菌各組試驗(yàn)結(jié)果差異不顯著(P>0.05)。0.04%試驗(yàn)組、0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，大腸桿菌分別降低了38.66%(P<0.05)、27.88%(P<0.05)、14.82%(P<0.05)。0.04%試驗(yàn)組、0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，沙門(mén)氏菌分別降低了40.75%(P<0.05)、28.31%(P<0.05)和 15.67%(P<0.05)。0.04%試驗(yàn)組、0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，產(chǎn)氣莢膜梭菌分別降低了 27.22%(P<0.05)、20.28%(P<0.05)和 8.86%(P<0.05)。0.04%試驗(yàn)組、0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，摩氏變形菌分別降低了35.37%(P<0.05)、24.23%(P<0.05)、12.24%(P<0.05)。

2.3 膨化殼聚糖銅對(duì)斷奶仔豬直腸微生物的影響

見(jiàn)表5。

表5 膨化殼聚糖銅對(duì)仔豬直腸微生物(×105 CFU/g)的影響

由表5可知：直腸段0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，乳酸桿菌分別提高了23.81%(P<0.05)、14.64%(P<0.05)，其0.04%試驗(yàn)組和0.02%試驗(yàn)組相比差異不顯著(P>0.05)。0.04%試驗(yàn)組、0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，雙歧桿菌分別提高了34.02%(P<0.05)、27.26%(P<0.05)、17.41%(P>0.05)。0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，芽孢桿菌分別提高了27.10%(P<0.05)、16.06%(P<0.05)，其0.04%試驗(yàn)組和0.02%試驗(yàn)組相比差異不顯著(P>0.05)。擬桿菌各組試驗(yàn)結(jié)果差異不顯著(P>0.05)。0.04%試驗(yàn)組、0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，大腸桿菌分別降低了32.30%(P<0.05)、23.33%(P<0.05)、11.10%(P<0.05)。0.04%試驗(yàn)組、0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，沙門(mén)氏菌分別降低了35.60%(P<0.05)、26.34%(P<0.05)和13.18%(P<0.05)。0.04%試驗(yàn)組、0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，產(chǎn)氣莢膜梭菌分別降低了 29.62%(P<0.05)、19.94%(P<0.05)和10.41%(P<0.05)。0.04%試驗(yàn)組、0.02%試驗(yàn)組和0.01%試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，摩氏變形菌分別降低了27.71%(P<0.05)、21.33%(P<0.05)、10.51%(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，日糧中添加0.02%膨化殼聚糖銅可顯著促進(jìn)大腸內(nèi)有益菌乳酸桿菌、雙歧桿菌和芽孢桿菌的增殖，顯著降低有害菌大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和摩氏變形菌的數(shù)量。

研究表明，膨化殼聚糖銅具有較強(qiáng)的抗菌、殺菌及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用[13-14]。馮小強(qiáng)等[15]發(fā)現(xiàn)殼聚糖銅(Ⅱ)配合物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有顯著的抑菌作用。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，0.02%試驗(yàn)組能顯著降低大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和摩氏變形菌等有害菌菌群數(shù)量(P<0.05)，同時(shí)提高乳酸桿菌、雙歧桿菌和芽孢桿菌等有益菌菌群(P<0.05)的數(shù)量。