王 倩，孫虎芝，劉 爽，閆艷新，潘 強(qiáng)，任慧英

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島266109 ； 2.青島諾安百特生物技術(shù)有限公司，山東青島266109)

豬滲出性皮炎又稱豬油皮病，是由葡萄球菌引起的豬皮膚表層組織的一種炎癥，以全身油脂樣滲出為典型特征，形成皮痂并脫落，甚至導(dǎo)致脫水和死亡等臨床癥狀。該病主要侵害哺乳仔豬，尤其是剛出生3～5日齡的仔豬發(fā)病率高，傳染迅速、死亡率也高。本病傳染很快，只要有一頭仔豬發(fā)病，1～2 d將會(huì)波及全窩，經(jīng)3～5 d擴(kuò)散到幾窩或整座產(chǎn)仔舍。臨床上治療該病通常用慶大霉素、林可霉素等抗菌藥物，但往往會(huì)導(dǎo)致病豬生長(zhǎng)停滯。由于抗生素在養(yǎng)殖過(guò)程中大量用于疾病預(yù)防及治療，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重，耐甲氧西林葡萄球菌大量地出現(xiàn)在人醫(yī)和獸醫(yī)臨床，給疾病的治療帶來(lái)巨大的麻煩。因此，需要研發(fā)新型的抗菌藥物，以控制耐藥性細(xì)菌引起的感染。

噬菌體作為一種天然的抗菌生物制劑，能夠?qū)Ω锾m陽(yáng)性菌和陰性菌都有裂解作用，特別具有多重耐藥性的病原菌都有較好的裂解效果[1-3]。噬菌體與抗生素相比具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：具有相當(dāng)?shù)姆N屬特異性，只侵染特定的病原微生物，但不會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成菌群失調(diào)；噬菌體的殺菌過(guò)程就是噬菌體的增殖過(guò)程，只要有敏感細(xì)菌存在，噬菌體就可以在細(xì)菌存在部位維持相當(dāng)?shù)臄?shù)量[4]。另外，噬菌體較抗生素的研發(fā)用時(shí)短，且更易從自然界分離獲得。噬菌體在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)、食品等各個(gè)領(lǐng)域越來(lái)越受到重視[4-5]。本研究以豬源葡萄球菌為宿主菌，進(jìn)行烈性噬菌體的分離，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以期為豬滲出性皮炎的噬菌體治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 豬源葡萄球菌菌株由課題組分離鑒定并保存。分離噬菌體用的污水及墊料來(lái)自山東青島、威海、煙臺(tái)等地豬場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 將污水與污物加入到200 mL無(wú)菌LB肉湯中，取2 mL宿主菌JTB1-3到200 mL肉湯中，37 ℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)，自然沉淀3 h，取上清，10 000 r/min離心10 min后用0.22 μm的濾器過(guò)濾，收集濾液。

1.2.2 雙層平板法分離噬菌體 將濾液與葡萄球菌菌懸液各200 μL混合后，37 ℃溫箱中孵育5 min，將混合液加入含有0.7%瓊脂的LB上層瓊脂中混勻，將上層瓊脂倒入到下層的營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，于37 ℃溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)，觀察有無(wú)噬菌斑[1]。

1.2.3 噬菌體的純化 摳取單個(gè)噬菌斑與1 mL LB肉湯中，40 ℃水浴30 min，10 000 r/min離心5 min，將浸出液適當(dāng)稀釋后與宿主菌鋪板，重復(fù)摳斑、浸出、離心進(jìn)行純化，直到得到大小和形態(tài)均勻的噬菌斑。

1.2.4 噬菌體的電鏡觀察 取20 μL噬菌體增殖液懸滴于微孔銅網(wǎng)上，沉淀15 min，用濾紙吸去多余的液體。在銅網(wǎng)上滴加15 μL的2%磷鎢酸(PTA)。染色5 min，用濾紙吸去多余的染液，干燥后用透射電鏡觀察。

1.2.5 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)的測(cè)定 增殖噬菌體和宿主菌，測(cè)定噬菌體效價(jià)及宿主菌濃度，按照感染復(fù)數(shù)為10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01的比例各取100 μL分別加入噬菌體的新鮮增殖液和宿主菌，加入到LB液體培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)體系的總體積一致。于37 ℃，170 r/min振蕩培養(yǎng)至液體變澄清，10 000 r/min離心5 min，取上清用雙層平板法測(cè)效價(jià)，每組做兩個(gè)平行樣，取平均值[1]。

1.2.6 噬菌體一步生長(zhǎng)曲線繪制 將200 μL噬菌體與宿主菌混合(噬菌體數(shù)多于細(xì)菌數(shù))，10 000 r/min離心30 s，棄上清，用500 μL LB肉湯洗滌兩次并棄上清。用預(yù)熱的LB肉湯混懸沉淀至5 mL，置于37 ℃，170 r/min震蕩培養(yǎng)，從零時(shí)刻開(kāi)始，前2 h每隔10 min，2～8 h每隔30 min，取出200 μL的混合液，10 000 r/min離心3 min取上清測(cè)效價(jià)，每組做兩個(gè)平行，繪制一步生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 噬菌體pH值穩(wěn)定性試驗(yàn) 取無(wú)菌試管中加入不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的LB肉湯4.5 mL，各3支，然后將試管置于37 ℃的水浴鍋中，待溫度穩(wěn)定之后，各加入500 μL噬菌體增殖液，混勻37 ℃水浴作用1 h、2 h、3 h。作用結(jié)束之后，向混合液中加入適量的1 mol/L的HCl或者NaOH使混合液的pH值約為7，再連續(xù)進(jìn)行10倍比稀釋，用雙平板法測(cè)定噬菌體的效價(jià)，每組做兩個(gè)平行[5]。

1.2.8 噬菌體熱穩(wěn)定性試驗(yàn) 各取100 μL噬菌體增殖液分裝于1.5 mL離心管中，分別于40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃水浴中作用20 min、40 min、60 min，每個(gè)溫度設(shè)兩個(gè)平行組。待作用結(jié)束后取出樣品，并立即放入冷水中冷卻，雙層平板法測(cè)噬菌體的效價(jià)。

1.2.9 噬菌體對(duì)氯仿敏感性試驗(yàn) 向5 mL噬菌體加入200 μL氯仿置于37 ℃，170 r/min振蕩培養(yǎng)30 min，離心取上清測(cè)效價(jià)。對(duì)照組不加氯仿，加入等量的液體LB，其他處理相同。

1.2.10 噬菌體對(duì)病原菌的體外裂解試驗(yàn) 按照感染復(fù)數(shù)為10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01的比例各取50 μL分別加入噬菌體的新鮮增殖液和宿主菌于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，做陰陽(yáng)性對(duì)照。置于37 ℃，170 r/min振蕩培養(yǎng)，前3 h每隔0.5 h，4～12 h每隔1 h，放在酶標(biāo)儀上讀取OD630值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD630值為縱坐標(biāo)，繪制曲線。

1.2.11 噬菌體裂解譜的測(cè)定 采用單斑法測(cè)定噬菌體裂解譜。取100 μL待測(cè)菌用無(wú)菌棉棒均勻涂在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，待菌液充分吸收后取1 μL噬菌體點(diǎn)到涂好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，將平板置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)，10 h后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體分離結(jié)果 利用雙層平板法從豬場(chǎng)污水中分離到1株噬菌體，形成圓形透明、邊緣清晰、直徑約為1 mm噬菌斑。

2.2 噬菌體的電鏡觀察 純化的噬菌體vB-StaM-JTB經(jīng)負(fù)染后，在透射電鏡下的形態(tài)如圖1所示，噬菌體形態(tài)為蝌蚪狀，頭部為二十面體的立體對(duì)稱，直徑約100 nm，噬菌體有一可伸縮性長(zhǎng)尾，長(zhǎng)約220 nm。根據(jù)2011年國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)第9次報(bào)告提出的噬菌體分類(lèi)與命名標(biāo)準(zhǔn)，該噬菌體符合有尾噬菌體目(Caudovirales)肌尾噬菌體科(myoviridae)的特征。根據(jù)命名原則，將該噬菌體命名為vB-StaM-JTB。

圖1 噬菌體vB-StaM-JTB電鏡下形態(tài)

2.3 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù) 結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知感染復(fù)數(shù)(MOI)= 0.0001時(shí)噬菌體感染宿主菌產(chǎn)生子代噬菌體的滴度為3×109PFU/mL，在7個(gè)感染復(fù)數(shù)中噬菌體滴度最高，因此確定噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)是0.000 1。

表1 噬菌體vB-StaM-JTB感染復(fù)數(shù)測(cè)定結(jié)果

2.4 噬菌體一步生長(zhǎng)曲線 由圖2可見(jiàn)，噬菌體在80 min內(nèi)數(shù)量未見(jiàn)明顯增加，該階段為噬菌體潛伏期；在感染后80 min～5 h，噬菌體的數(shù)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，該階段為該噬菌體的暴發(fā)期。即該噬菌體的潛伏期約80 min，裂解期約220 min。根據(jù)暴發(fā)量=暴發(fā)末期噬菌體滴度/感染初期宿主菌濃度計(jì)算得出，噬菌體的裂解量為77，即每個(gè)被感染細(xì)菌產(chǎn)生子代噬菌體的平均數(shù)量約為77個(gè)。

圖2噬菌體vB-StaM-JTB的一步生長(zhǎng)曲線

2.5 噬菌體pH值穩(wěn)定性試驗(yàn) 噬菌體vB-StaM-JTB的pH值穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)圖3。噬菌體vB-StaM-JTB在pH值6～9范圍內(nèi)其效價(jià)均在108PFU/mL以上，具有穩(wěn)定和良好的裂解活性。隨著pH值的降低或升高，噬菌體活性顯著下降，當(dāng)pH值=2時(shí)作用2 h以及pH值=13作用1 h時(shí)，噬菌體完全失去感染宿主的能力。

圖3噬菌體vB-StaM-JTBpH值穩(wěn)定性

2.6 噬菌體的熱穩(wěn)定性試驗(yàn) 噬菌體vB-StaM-JTB的熱穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)圖4。在40 ℃作用1 h之后基本可以保持原效價(jià)，50 ℃作用20 min效價(jià)下降4個(gè)數(shù)量級(jí)，60 min基本失活。60 ℃作用20 min完全失活。

圖4噬菌體vB-StaM-JTB熱穩(wěn)定性

2.7 噬菌體vB-StaM-JTB對(duì)氯仿敏感性試驗(yàn) 通過(guò)圖5噬菌體vB-StaM-JTB與氯仿相互作用結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氯仿處理后噬菌體，效價(jià)下降一個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明該噬菌體對(duì)氯仿敏感。

2.8 噬菌體對(duì)病原菌的體外裂解試驗(yàn) 噬菌體與宿主菌以不同感染復(fù)數(shù)混合培養(yǎng)后，一開(kāi)始細(xì)菌在增殖OD值增大，之后噬菌體在不同MOI下裂解細(xì)菌，OD值下降。隨著時(shí)間的推移，最終OD值都能夠下降到只加噬菌體的陰性對(duì)照的OD值，在8 h時(shí)細(xì)菌幾乎被裂解完全且12 h無(wú)抗性菌產(chǎn)生。不加噬菌體的細(xì)菌對(duì)照孔的OD值一直上升。如圖6所示。

圖5噬菌體vB-StaM-JTB氯仿敏感性

圖6噬菌體vB-StaM-JTB的體外裂解試驗(yàn)

2.9 噬菌體裂解譜的測(cè)定 噬菌體vB-StaM-JTB對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的171株豬源的葡萄球菌進(jìn)行噬菌體的裂解譜分析，結(jié)果表明，共有124株葡萄球菌可以被噬菌體vB-StaM-JTB裂解，裂解率可以達(dá)到71.93%。

3 討論

本試驗(yàn)從污水中分離純化出1株肌尾噬菌體vB-StaM-JTB，為了更好地利用噬菌體開(kāi)展噬菌體治療，對(duì)其生物學(xué)特效進(jìn)行了研究。不同地區(qū)分離到的同種細(xì)菌的噬菌體以及不同形態(tài)的噬菌體生物學(xué)特性都可能不一致[6]，尤其是在pH值、熱穩(wěn)定性、最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長(zhǎng)曲線以及裂解譜等方面存在較大差異。vB-StaM-JTB經(jīng)50 ℃ 20 min處理后基本失活，而蔡天舒等[7]以金黃色葡萄球菌ATCC6538為宿主菌分離到的長(zhǎng)尾噬菌體在60 ℃條件下作用40 min后，其存活率仍在50%。過(guò)高的溫度會(huì)影響噬菌體對(duì)細(xì)菌的吸附也會(huì)造成噬菌體空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化失去裂解活性。vB-StaM-JTB對(duì)酸堿較敏感，pH值在6～9范圍內(nèi)時(shí)，其效價(jià)變化不大，但是強(qiáng)酸強(qiáng)堿對(duì)vB-StaM-JTB都會(huì)產(chǎn)生很大影響，生產(chǎn)中使用時(shí)應(yīng)考慮酸堿消毒劑的配合使用問(wèn)題。噬菌體vB-StaM-JTB和宿主菌的比例為0.000 1時(shí)，所得到的子代噬菌體的效價(jià)最高。鞠磊等[8]以S.aureus43300為宿主菌分離得到的金黃色葡萄球菌肌尾噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)為 0.001，與之相比vB-StaM-JTB具有較強(qiáng)的增殖效率。感染復(fù)數(shù)不同，子代噬菌體的產(chǎn)率也會(huì)有較大的差異，這一生物學(xué)特性指標(biāo)為后續(xù)噬菌體生產(chǎn)中噬菌體與細(xì)菌用量比提供了一個(gè)依據(jù)。噬菌體vB-StaM-JTB對(duì)分離自不同地區(qū)的豬源葡萄球菌具有廣泛的裂解譜，且具有增殖速度快，抗性菌不易產(chǎn)生等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)將對(duì)葡萄球菌引起的仔豬滲出性皮炎的噬菌體治療奠定基礎(chǔ)。