金刺梨黑斑病病原菌生物學特性及室內(nèi)藥劑毒力測定

張秀偉，蔡甫格，潘中濤，李用奇，鮑 菊

(貴州省安順市農(nóng)業(yè)科學院，貴州安順561000)

金刺梨(Rosa sterilis var.)是貴州省特有的新興果樹，是刺梨的近緣種，屬薔薇科薔薇屬。2015年2月12日金刺梨通過植物新品種審定，定名為金果，是貴州省第1個植物新品種權(quán)，得到國家相關(guān)法律的保護。金刺梨果實富含維生素C、葉酸、胡蘿卜素、超氧化物歧化酶、人體所需氨基酸等，同時還含有抗白血病的天門冬氨酸，是一種食藥兼用的綠色保健食品，具有很高的商品價值與推廣價值。但由于金刺梨是一種野生果樹資源，馴化栽培歷史短，果農(nóng)對其病蟲害不了解，在病蟲害發(fā)生時盲目用藥，不僅得不到有效防治，還提高了管理成本，造成很大的經(jīng)濟損失?！笆濉逼陂g貴州省安順市金刺梨的種植面積達1.3萬hm2，隨著種植面積的增加，金刺梨的病蟲害也日益嚴重。因此，對金刺梨的病蟲害進行相關(guān)研究，新確認2種病害，分別為黑斑病、褐斑病，其中黑斑病在局部區(qū)域發(fā)生，但病害一旦發(fā)生會直接導致金刺梨產(chǎn)量大幅度下降，黑斑病于金刺梨開花期發(fā)病，主要危害金刺梨幼嫩的果梗，初期在果枝上形成紫色不規(guī)則病斑，后期病斑連成片，形成黑色凹陷病斑，繞果枝一周，表皮干腐狀，染病后期輕輕觸碰果梗，整個花序全部脫落。采集黑斑病的病組織在室內(nèi)保濕培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)有白色黏質(zhì)團出現(xiàn)，證實該病主要由擬莖點霉屬(Phomopsis Sacc.)真菌侵染引起，本研究對該菌的生物學特性進行初步探討，并進行室內(nèi)藥劑篩選試驗，以期為該病害的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

于2015年5月在貴州省安順市農(nóng)業(yè)科學院金刺梨種植基地采集金刺梨黑斑病病樣，在貴州省安順市農(nóng)業(yè)科學院微生物實驗室內(nèi)進行病原菌的分離純化，通過回接試驗證明該菌為致病菌，經(jīng)形態(tài)學和rDNA－ITS測序鑒定該菌為擬莖點霉屬辣椒擬莖點霉真菌(P.capsici)，在PDA培養(yǎng)基(200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，18 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水)斜面上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 供試藥劑

70%甲基硫菌靈可濕性粉劑，購自日本曹達株式會社;75%百菌清可濕性粉劑，購自英國先正達有限公司;80%多菌靈可濕性粉劑，購自南京卓創(chuàng)化工有限公司;58%甲霜·福美雙可濕性粉劑，購自南京艾森精細化工有限公司;80%代森錳鋅可濕性粉劑，購自浙江省東陽農(nóng)藥廠。

1.3 病原菌生長條件

1.3.1 不同溫度對病原菌生長的影響 在無菌條件下，用直徑為5 mm的打孔器打取在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后的菌餅，菌餅要求生長一致，把菌餅接入PDA培養(yǎng)基平板中，分別放在 5、10、15、20、25、28、30、35、40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法分別測量各處理的菌落直徑，每個處理 3 次重復［1－2］。

1.3.2 不同pH值對病原菌生長的影響 用無菌NaOH溶液(1 mol/L)和HCl溶液(1 mol/L)將PDA培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)至 3、4、5、6、7、8、9、10，將直徑為 5 mm 的菌餅分別接入不同pH值的PDA培養(yǎng)基平板中，28℃恒溫培養(yǎng)，每個處理重復3次，培養(yǎng)5 d后測量菌落直徑。

1.3.3 不同培養(yǎng)基對病原菌生長的影響 將直徑為5 mm的菌餅分別接入PDA培養(yǎng)基、胡蘿卜培養(yǎng)基(100 g胡蘿卜、18 g瓊脂、1 000 mL蒸餾水)、燕麥培養(yǎng)基(20 g燕麥、18 g瓊脂、1 000 mL蒸餾水)、植物培養(yǎng)基(20 g金刺梨嫩枝葉、18 g瓊脂、1 000 mL蒸餾水)、水瓊脂培養(yǎng)基(20 g瓊脂、1 000 mL蒸餾水)、察氏培養(yǎng)基(3.00 g硝酸鈉、1.00 g磷酸氫二鉀、0.50 g 硫酸鎂、0.50 g 氯化鈉、0.01 g 硫酸亞鐵、30.00 g 蔗糖、18.00 g瓊脂、1 000.00 mL 蒸餾水)中，放入 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個處理重復3次，培養(yǎng)5 d后測量菌落直徑。

1.3.4 不同碳源、氮源對病原菌生長的影響 以真菌生理培養(yǎng)基［3－4］(1.0 g 氮源、0.5 g 磷酸二氫鉀、5.0 g 碳源、20.0 g瓊脂、1 000.0 mL蒸餾水)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將直徑為5 mm的菌餅接入不同碳源［果糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖、無碳源(CK)］、氮源［蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨、硝酸鉀、甘氨酸、無氮源(CK)］的培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)，每個處理重復3次，培養(yǎng)5 d后測量菌落直徑。

1.3.5 不同光照對病原菌生長的影響 取直徑為5 mm的菌餅，接入PDA培養(yǎng)基平板中，分別在連續(xù)光照(24 h光照)、間斷光照(12 h光照，12 h黑暗)、連續(xù)黑暗(24 h黑暗)條件下，于28℃恒溫培養(yǎng)，每個處理重復3次［5］，培養(yǎng)5 d后測量菌落直徑。

1.3.6 菌絲、孢子致死溫度的測定 分別在40、45、50、55、60℃恒溫水浴鍋的試管中加入1 mL用無菌水配制的孢子懸浮液;在加有2 mL無菌水的離心管中分別加入3塊直徑為5 mm的菌餅，處理10 min后，將其拿出冷卻，分別接種在PDA培養(yǎng)基平板上，每個處理重復3次［6］，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后觀察并記錄菌絲、孢子的生長情況。

1.4 室內(nèi)毒力測定

采用原藥室內(nèi)生長速率法［7－8］進行藥劑篩選，測量5種供試藥劑對金刺梨黑斑病病原菌毒力的大小。將供試藥劑原藥用無菌水配制成所需濃度，每種藥劑設(shè)置5個濃度，取1 mL藥液加入9 mL PDA培養(yǎng)基中，搖勻后倒入直徑為8 cm的培養(yǎng)皿中，取出培養(yǎng)7 d的病原菌菌落，打取直徑為5 mm的菌塊，移入到加藥的PDA平板培養(yǎng)基中，每種藥劑每個濃度設(shè)置3次重復，以加入1 mL無菌水的PDA培養(yǎng)基平板為對照。培養(yǎng)5 d后測量菌落直徑，計算抑菌率、各藥劑的毒力回歸方程、抑制中濃度(EC50)。抑菌率=［(對照菌落直徑－處理菌落直徑)/對照菌落直徑］×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對菌落生長的影響

由表1可知，金刺梨黑斑病病原菌在10～35℃均可生長，結(jié)合菌落濃密度得出該菌適宜的生長溫度為20～30℃，在25～30℃條件下菌落生長較快，最佳生長溫度為28℃，此時菌落直徑達到9.33 cm，與其他溫度相比差異顯著(p＜0.05)，且菌落生長濃密。在溫度低至5℃或高至40℃時菌落不能生長。

表1 不同溫度對菌絲生長的影響

2.2 不同pH值對病原菌生長的影響

由表2可知，病原菌對pH值的適應(yīng)范圍較寬，pH值為3～10時均可生長，pH值為4～6時生長速度較快，pH值為4時生長速度最快，此時菌落直徑達到4.58 cm，但菌絲較稀疏，pH值為5、6時生長速度次之，其菌落直徑分別為3.57、3.22 cm，且菌絲生長濃密，pH值呈堿性后菌絲生長速度變慢。

表2 不同pH值對菌絲生長的影響

2.3 不同碳源、氮源對病原菌生長的影響

由表3可知，該菌在幾類不同碳源培養(yǎng)基上均能生長，最適合菌絲生長的碳源為果糖，菌落直徑達4.73 cm，菌落濃密，其次為蔗糖、麥芽糖，菌落直徑分別為4.02、3.81 cm，且菌落濃密。在無碳源的情況下，該菌仍能生長，且生長速度較快，菌落直徑達到4.43 cm，僅次于果糖，但其菌絲較稀疏。由表4可知，在不同氮源中，以蛋白胨為氮源時該菌生長得最好，菌落直徑達到5.57 cm，且菌落濃密，其次為牛肉膏，菌落直徑為5.02 cm，菌落濃密。在無氮源情況下該菌也可生長，菌落直徑為3.57 cm，但菌落較稀疏。以甘氨酸為氮源時會抑制該菌生長。

表3 不同碳源對菌落生長的影響

表4 不同氮源對菌落生長的影響

2.4 不同培養(yǎng)基對病原菌生長的影響

由表5可知，病原菌在幾種培養(yǎng)基中均能生長，該菌在PDA培養(yǎng)基上，菌落濃密，菌落直徑達5.37 cm，與其他培養(yǎng)基相比差異顯著(p＜0.05)，其次為胡蘿卜培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基，菌落直徑分別為4.25、4.05 cm，但在察氏培養(yǎng)基上菌落較稀疏。該菌在水瓊脂培養(yǎng)基上生長較緩慢，直徑為2.27 cm，菌落較稀疏;在植物培養(yǎng)基上菌落直徑為3.38 cm，菌落較稀疏。

2.5 不同光照對病原菌生長的影響

由表6可知，病原菌在連續(xù)光照下生長速度最快，菌落直徑達到6.83 cm，與其他2種條件相比差異顯著(p＜0.05)，但菌落較稀疏，間斷光照與連續(xù)黑暗條件下的菌落直徑差異不顯著，菌落均較濃密。

2.6 菌絲、孢子的致死溫度

經(jīng)試驗證實，病原菌菌絲的致死溫度為55℃，孢子的致死溫度為50℃。

表5 不同培養(yǎng)基對菌落生長的影響

表6 不同光照對菌落生長的影響

2.7 藥劑篩選試驗

對金刺梨黑斑病病原菌進行室內(nèi)毒力測定，由表7、表8可知，幾種殺菌劑中80%多菌靈可濕性粉劑對該菌絲的抑制效果最好，EC50為0.56 mg/L;其次為75%百菌清可濕性粉劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑，其 EC50分別為 2.51、4.61 mg/L;80%代森錳鋅可濕性粉劑與58%甲霜·福美雙可濕性粉劑對該菌菌絲的抑制效果較差，EC50分別為17.53、24.46 mg/L。

3 結(jié)論與討論

金刺梨黑斑病病原菌生長溫度較寬泛，在10～35℃均能生長，最佳生長溫度為28℃，此時生長速度快且菌絲濃密;該菌喜歡弱酸環(huán)境，當pH值為4時生長速度最快，但菌絲較稀疏;對碳源要求不嚴格，在無碳源、多糖、單糖的情況下均能生長，以果糖為碳源時生長最好;在幾種供試氮源中除甘氨酸不適合該菌生長外，其他幾種氮源或無氮源條件下該菌均能生長，以蛋白胨為氮源時生長最好;金刺梨黑斑病病原菌對營養(yǎng)條件要求不嚴格，在6種培養(yǎng)基上均能生長，最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基;不同光照條件對該菌的生長速度有一定的影響，連續(xù)光照比其他2種光照條件生長快，但菌絲較稀疏;同時本研究的結(jié)果證實，該菌菌絲的致死溫度為55℃，孢子的致死溫度為50℃。

表7 不同藥劑對金刺梨黑斑病病原菌菌落生長的抑制效果

表8 不同殺菌劑對金刺梨黑斑病病原菌的毒力測定

目前，金刺梨黑斑病只是在局部區(qū)域發(fā)生，但危害較大，會直接導致金刺梨產(chǎn)量嚴重下降。本次試驗結(jié)果表明，80%多菌靈可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑對金刺梨黑斑病病原菌的抑制效果較好，58%甲霜·福美雙可濕性粉劑、80%代森錳鋅可濕性粉劑的效果較差，由于本研究只做了室內(nèi)藥劑試驗，還未進行室外大田試驗，該結(jié)論有待進一步證實。