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      桑椹成熟過程中1-脫氧野尻霉素和花青素含量變化規(guī)律

      2018-10-16 09:22:48黃金枝鄧真華俞燕芳胡桂萍彭曉虹杜賢明曹紅妹胡麗春
      蠶桑茶葉通訊 2018年4期
      關鍵詞:桑椹花青素乙腈

      黃金枝 鄧真華 俞燕芳 胡桂萍彭曉虹 杜賢明 曹紅妹 胡麗春

      ( 1.江西省蠶桑茶葉研究所330202; 2.江西省蠶桑工程技術研發(fā)中心)

      桑椹系??浦参锷5某墒旃麑?,又名桑果、桑實和桑棗。桑椹屬漿果類型,營養(yǎng)豐富,含有豐富的花色苷、白藜蘆醇等黃酮類活性成分以及多糖、氨基酸、碳水化合物、有機酸、維生素、礦物質等多種基礎營養(yǎng)成分[1],是制作現代食品和保健產品的優(yōu)質天然原料[2~3]。

      桑椹收獲時間比較集中,果皮薄,汁液多,組織嬌嫩,在收獲和運輸的過程中很容易軟化、腐爛,并且嚴重影響它的營養(yǎng)和經濟價值。通過了解桑椹發(fā)育成熟期間的營養(yǎng)活性成分含量變化規(guī)律,能夠為桑椹適時采摘和實施相應的保鮮技術措施提供理論依據。

      1 材料與方法

      1.1 材料及主要試劑和儀器

      試驗對象為無籽果桑大十,采自江西省蠶桑茶葉研究所果桑園。對桑椹果實的發(fā)育期進行劃分,依次為全綠期、半粉紅期、粉紅期、全紅期和紫黑期[4]。同一發(fā)育期采摘桑椹2 kg,并迅速帶回實驗室,存放在-80℃冰箱中備用。測定時將其研磨混勻,準確稱取一定重量,重復取3次,用于成熟過程中DNJ和花青素含量測定。

      生物堿標準品為1-脫氧野尻霉素,花青素標準品為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷。鹽酸、硼酸鉀、FMOC-Cl、乙腈、甘氨酸、醋酸、乙醇、偏磷酸、磷酸為色譜純。

      設備:Agilent 1260高效液相色譜(美國安捷倫科技公司)。

      1.2 桑椹生物堿的測定[5]

      1.2.1 樣品制備

      取新鮮桑椹10g,研磨均勻,得到桑椹漿,取10g桑椹漿于50mL離心管中,加入0.05mol/L鹽酸溶液10mL,渦旋提取3min,離心15min(轉速12 000r/min),取上清液,同法重復提取一次,離心,合并2次提取液并轉移至50mL容量瓶,蒸餾水定容即得。

      1.2.2 標準溶液配制及工作曲線建立

      準確稱取20mgDNJ標準品于25mL容量瓶中,加超純水溶解并定容,即得0.8g/L的DNJ標準溶液,稀釋至質量濃度為60μg/mL、120μg/mL、180μg/mL、240μg/mL、300μg/mL、480μg/mL備用。以DNJ的質量濃度為縱坐標,吸光度為橫坐標繪制標準曲線,得DNJ的標準曲線線性回歸方程。

      1.2.3 衍生化反應[5]

      取DNJ提取液(或DNJ標準液)100μL,再加入5mmol/L的FMOC-Cl(溶解于乙腈中)200μL,混勻后于25℃水浴20min。加入1mol/L甘氨酸100μL中和剩余的FMOC-Cl以終止反應,加入1%醋酸100μL及超純水400μL,以0.45μm微孔濾膜過濾器過濾,收集濾液備測??瞻讓φ找哉麴s水代替DNJ提取液進行衍生化反應。

      1.2.4 HPLC檢測條件[5]

      色譜柱C18柱(150mm×4.6mm×5μm);熒光檢測器激發(fā)波長254nm,發(fā)射波長322nm;流動相為乙腈-0.1%醋酸(體積比50:50);流速1.0mL/min;柱溫25℃;進樣量10μL。

      1.3 桑椹花青素的測定[6]

      1.3.1 樣品制備

      取新鮮桑椹10g,研磨均勻,得到桑椹漿,取5g桑椹漿加入20mL酸性乙醇(含1%HCl),超聲波提取30min,12 000r/min離心10min,取上清液作檢測樣品。

      1.3.2 標準溶液配制及工作曲線建立

      準確稱取C3G標準品1mg和C3R標準品1mg,分別加入1mL和500μL混合液(無水乙醇:偏磷酸:超純水=3:1:6)作為儲備液,4℃保存?zhèn)溆谩R再|量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,建立花青素標準曲線。

      1.3.3 HPLC檢測條件[6]

      譜柱:ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)。流動相A為乙腈,B為0.4%磷酸。流動相A洗脫程序為:0~10min,9%~15%乙腈;10~20min,15%~35%乙腈;20~24min,35%~9%乙腈。流動相B洗脫程序為:0~10min,91%~85%磷酸;10~20min,85%~65%磷酸;20~24min,65%~91%磷酸。流速1.0mL/min,檢測波長520nm,柱溫30℃,進樣量20μL。

      1.4 數據分析

      采用Excel對測定數據進行處理分析。

      2 結果與分析

      2.1 桑椹成熟過程中DNJ含量變化

      采用HPLC法對桑椹成熟期間的DNJ含量進行檢測,以標準品的質量濃度為橫坐標,色譜峰面積為縱坐標,得到DNJ含量檢測的標準工作曲線y=6.667x+35.26(R2=0.999),通過峰面積與標準曲線計算出桑椹成熟過程中DNJ的含量,所得結果見圖1。如圖1所示,桑椹從全綠期到紫黑期,桑椹中的 DNJ含量逐漸下降,至紫黑期含量為零。即全綠期 DNJ 含量較高,而隨著桑椹的不斷成熟,DNJ 含量逐漸減少,說明 DNJ主要存在于其幼嫩和重要的組織器官之中,如嫩葉、幼果等。全綠期桑椹中DNJ含量較高,但果品質較差,多糖和黃酮含量較少,不適合桑椹深加工,DNJ含量也遠低于桑葉,也不合適作為生產 DNJ 產品的原料開發(fā)[7]。

      圖1 桑椹成熟過程中DNJ 含量變化

      2.2 桑椹成熟過程中花青素含量變化

      采用HPLC法對桑椹成熟過程中的花青素含量進行檢測,以標準品的質量濃度為橫坐標,色譜峰面積為縱坐標,得到C3G含量檢測的標準工作曲線y=3639x-4.381(R2=0.999),C3R含量檢測的標準工作曲線y=6756.5x+49.243(R2=0.997)。通過峰面積與標準曲線計算桑椹成熟期間C3G和C3R的含量,結果如圖2所示。桑椹在成熟過程中C3G和C3R含量都呈現逐漸增加的趨勢,在桑椹半粉紅期前均緩慢增加,粉紅期后2種花青素的含量急劇上升;2種花青素的含量差異很大,C3R含量高于C3G含量。桑椹在成熟過程中,外觀顏色會由綠色變?yōu)榉奂t色,再到紫紅色,最后變?yōu)樽虾谏@種外觀顏色的變化,主要有兩方面的原因:①在成熟過程中葉綠素逐漸降解,花青素含量逐漸積累;②隨著pH值上升,花色苷的色調發(fā)生了改變。

      圖2 桑椹成熟過程中花青素含量的變化

      3 討論

      生物堿DNJ作為一種高效的α-糖苷酶抑制劑,是桑樹體內次生代謝產生的一種重要防御物質[8~9]。從本實驗的檢測結果可以看出,桑椹在全綠期的DNJ含量很高,而隨著桑椹逐漸成熟,DNJ含量逐漸減少。本實驗檢測在桑椹全綠期花青素的含量幾乎為0,隨后逐漸緩慢增加,到粉紅期開始大量合成花青素,其含量迅速增加,紫黑期桑椹中花青素C3G和C3R的含量均達到最大值,這與在葡萄、荔枝等果實中的研究結果一致[10~11]。在桑椹成熟期間,DNJ含量逐漸減少,而C3G和C3R的含量逐漸增多,因此,生產上需根據加工桑椹食品的保健功效采收不同成熟期的桑椹做原料。

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