曹丹 任艷 羅曉光 魏玲

隨著人口老齡化趨勢(shì)到來(lái), 帕金森氏病(PD)這一中老年常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性病越受到研究者重視, 其發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而顯著增加, 85歲以上的老人接近50%有輕度PD樣癥狀。其發(fā)病機(jī)制可能與年齡老化、環(huán)境因素、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、膠質(zhì)細(xì)胞增生和炎癥反應(yīng)等有關(guān), 但線粒體功能障礙早已成為早期病理現(xiàn)象受到研究者們的關(guān)注。迄今為止有關(guān)PD的治療均為對(duì)癥治療, 無(wú)法進(jìn)行根本有效的病因治療。因此, 尋找一種能減少多巴胺(DA)能神經(jīng)元丟失及阻斷或延緩病程發(fā)展的治療方法是目前亟待解決的難題。

1 材料與方法

1.1 材料 MI為原代大鼠的神經(jīng)MI(購(gòu)于PriCells生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2 MI培養(yǎng) MI取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn), 以終濃度100 ng/ml PMA刺激MI 72 h后為共育時(shí)所需老化MI。

1.3 PC12傳代培養(yǎng) 復(fù)蘇后的PC12細(xì)胞并傳代培養(yǎng)(購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研究所), 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。以低劑量250 nM魚(yú)藤酮刺激PC12細(xì)胞8 h后, 收集損傷PC12細(xì)胞于24孔板上。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 將刺激后的MI及轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)移入有受損的PC12細(xì)胞的培養(yǎng)板內(nèi)建立兩種細(xì)胞的共育系統(tǒng), 實(shí)驗(yàn)分為3組：A組(空白對(duì)照組)： PC12細(xì)胞, 未給予任何處理藥物；B組：PC12與老化MI共育；C組：魚(yú)藤酮損傷PC12與老化MI共育。共育24 h結(jié)束后移走轉(zhuǎn)移篩板及其上面的細(xì)胞,對(duì)收集PC12細(xì)胞進(jìn)行膜電位及ROS檢測(cè)。

1.5 MI老化相關(guān)β-半乳糖苷酶(β-gal)染色 每孔加入300 μl β-gal染色固定液, 室溫固定 15 min；PBS洗滌3次；每孔加入300 μl染色工作液(試劑盒購(gòu)于上海碧云天)；37℃無(wú)CO2溫箱孵育過(guò)夜；普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 PC12細(xì)胞線粒體膜電位檢查 采用JC-1標(biāo)記法(試劑盒購(gòu)于碧云天, 上海), 加入500 μl JC-1染色工作液, 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min, 吸除上清, 用JC-1染色緩沖液洗滌2次, 加入400 μl細(xì)胞培養(yǎng), 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.7 PC12細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè) 細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的2', 7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)(10 μmol/L)中,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下,使探針和細(xì)胞充分接觸, 無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次, 流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 多組資料用One-Way ANOVA方法進(jìn)行比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 老化MI形態(tài)鑒定 β-gal是一種鑒別細(xì)胞衰老的生物學(xué)標(biāo)志。細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的藍(lán)色沉淀物即表明細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, PMA刺激MI藍(lán)染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加。

2.2 老化MI及魚(yú)藤酮干預(yù)對(duì)PC12細(xì)胞線粒體膜電位的影響 線粒體膜電位是細(xì)胞損傷極為敏感的指標(biāo)之一, 膜電位的下降可以反映細(xì)胞凋亡早期的變化。本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12細(xì)胞線粒體膜電位, 用FL1/FL2評(píng)價(jià)線粒體損傷情況, 比值越高損傷越嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, C組FL1/FL2最高, B組、C組FL1/FL2均高于A組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。說(shuō)明C組細(xì)胞線粒體膜電位最低, B組、C組細(xì)胞線粒體膜電位均低于A組。

表1 三組FL1/FL2比較( ±s, n=3)

表1 三組FL1/FL2比較( ±s, n=3)

注：與A組比較, aP＜0.05

組別 FL1/FL2 A組 1.03±0.16 B組 1.40±0.10a C組 1.57±0.14a

2.3 老化MI及魚(yú)藤酮干預(yù)對(duì)PC12細(xì)胞ROS水平的影響 本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)二氯二氫熒光素(DCF)熒光強(qiáng)度, 用平均熒光強(qiáng)度值評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, C組細(xì)胞DCF熒光強(qiáng)度最高, B組、C組與A組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。說(shuō)明C組細(xì)胞ROS水平最高, B組、C組細(xì)胞ROS水平高于A組。

表2 三組DCF熒光強(qiáng)度比較(±s, n=3)

表2 三組DCF熒光強(qiáng)度比較(±s, n=3)

注：與A組比較, aP＜0.05

組別 DCF熒光強(qiáng)度A組 171.07±17.26 B組 846.97±25.08a C組 982.72±25.1a

3 討論

MI的激活和炎癥反應(yīng)在PD 神經(jīng)變性病中的作用越來(lái)越受到學(xué)者的重視［1］。大量病理學(xué)證據(jù)均支持MI過(guò)度活化是黑質(zhì)區(qū)DA神經(jīng)元損傷的重要原因, 推測(cè)老化MI可分泌各種炎性介質(zhì), 持續(xù)對(duì)周?chē)h(huán)境施加影響。當(dāng)腦內(nèi)老化MI大量存在時(shí), 微環(huán)境發(fā)生改變, 遭遇病理刺激后發(fā)生過(guò)度炎癥反應(yīng), 引發(fā)氧化應(yīng)激產(chǎn)物的大量釋放, 促進(jìn)了DA神經(jīng)元的死亡。研究發(fā)現(xiàn), 線粒體損傷及功能改變?cè)诩?xì)胞凋亡過(guò)程中起到重要作用, 線粒體功能下降包括膜電位減低, 氧化磷酸化-電子傳遞偶聯(lián)異常等, 最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡［2］。調(diào)控細(xì)胞凋亡的一些因子, 如細(xì)胞色素C(Cyt-C)、Bcl-2家族、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶前體等都定位于線粒體內(nèi), 從而破壞線粒體膜的通透性和完整性。

魚(yú)藤酮是一種特異性線粒體復(fù)雜體Ⅰ抑制劑［3］。通過(guò)抑制線粒體復(fù)合體Ⅰ, 促進(jìn)ROS的形成, 產(chǎn)生氧化應(yīng)激導(dǎo)致線粒體功能障礙, 從而導(dǎo)致DA神經(jīng)元的死亡。本實(shí)驗(yàn)中老化MI同損傷的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行共育, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 老化MI顯著減低了正常PC12和受損PC12的線粒體膜電位并且提高了ROS分泌水平。提示在本實(shí)驗(yàn)環(huán)境下, 老化MI不利于損傷神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù), 具有神經(jīng)毒性作用。

近年來(lái), 越來(lái)越多研究證實(shí)自由基在PD發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。當(dāng)線粒體呼吸鏈?zhǔn)艿揭种? 線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換可誘導(dǎo)ROS生成。當(dāng)防御機(jī)制受到攻擊時(shí), 大量氧自由基積聚造成對(duì)膜不飽和脂肪酸的攻擊, 引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用,使以丙二醛為主的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物增多, 進(jìn)一步引起細(xì)胞代謝和功能障礙, 造成細(xì)胞損傷［4］。ROS是魚(yú)藤酮誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡的最重要因素之一。魚(yú)藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞ROS水平的增加, 在老化MI刺激下, ROS生成進(jìn)一步加重, 從而進(jìn)一步損害線粒體電子傳遞。本研究發(fā)現(xiàn), 在老化微環(huán)境中魚(yú)藤酮組PC12可顯著增加ROS水平。

綜上所述, 線粒體損傷與PD的關(guān)系非常緊密, 一方面可以為疾病提供早期診斷提供依據(jù), 從亞細(xì)胞和分子水平研究其與PD的關(guān)系, 另一方面對(duì)新藥研發(fā)的設(shè)計(jì)都有重要的指導(dǎo)意義。