奶粉中維生素D3含量的測定

文/房啟波 于春艷

（黑龍江搖籃乳業(yè)股份有限公司）

維生素D是一種脂溶性維生素，是人類生長發(fā)育過程中不可缺少的重要物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)嬰幼兒、孕婦、中老年等人群均是維生素D不足的高危人群。維生素D缺乏不僅導(dǎo)致鈣的吸收利用降低，出現(xiàn)佝僂病、骨軟化癥、骨量減少及骨質(zhì)疏松，而且可能導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能紊亂。

嬰幼兒配方奶粉和功能奶粉中均對維生素D（一般添加維生素D3）進(jìn)行了強(qiáng)化，可以滿足嬰幼兒、孕婦、中老年等人群維生素D補(bǔ)充的需要。準(zhǔn)確測定奶粉中維生素D的含量具有十分重要的意義。本文采用高效液相色譜法，使用外標(biāo)法定量對奶粉中的維生素D3含量進(jìn)行測定。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器

分析天平（感量為0.1 mg）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；磁力攪拌器；氮吹儀；紫外分光光度計（UV1800）；萃取凈化振蕩器；高效液相色譜儀（帶紫外檢測器，LC20A）。

1.1.2 試劑

無水乙醇（色譜純）；抗壞血酸；氫氧化鉀；正己烷；二丁基羥基甲苯（B u t y l a t e d Hydroxytoluene，BHT）；石油醚（沸程30～60 ℃）；無水硫酸鈉；甲醇（色譜純）。

維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品，純度＞98%，配制成濃度約為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使用前用紫外分光光度計對濃度進(jìn)行校正，標(biāo)準(zhǔn)中間液和使用液的準(zhǔn)確濃度需按照校正后的濃度折算。

維生素D3標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度校正方法：取維生素D3標(biāo)準(zhǔn)儲備液100μL于10 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，混勻，倒入1 cm石英比色杯中，以無水乙醇為空白參比，在264 nm波長下測定其吸光度（A）。濃度（C）計算公式：C=A×104/E，其中維生素D3的E值為462。

1.2 樣品處理

稱取5 g樣品于150 mL三角瓶中，加入20 mL溫水溶解，加入1.0 g抗壞血酸和0.1 gBHT，混勻。然后加入30 mL無水乙醇，再加入10 mL氫氧化鉀溶液，邊加邊振搖，混勻后放置在恒溫磁力攪拌器上，80 ℃回流皂化30 min，皂化后立即用冷水冷卻至室溫。

將皂化液轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗中，加入50 mL石油醚振蕩萃取5 min，萃取過程注意排氣。然后將水相轉(zhuǎn)移至另一分液漏斗中，再加50 mL石油醚進(jìn)行二次萃取，合并石油醚液。隨后用約100 mL水洗滌石油醚層，重復(fù)3 次至溶液近中性。

石油醚層經(jīng)無水硫酸鈉過濾入250 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，過濾后用約15 mL石油醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉2～3 次，并入蒸發(fā)瓶中，40 ℃濃縮至近干，氮?dú)獯蹈?，用正己烷定容? mL，渦旋振蕩，充分混勻，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，待凈化。

1.3 凈化

由于維生素D的異構(gòu)形式較多，不易與其它化合物分離，較難測定，為了排除干擾，樣品測定前需通過正相色譜凈化富集。

取1 mL維生素D3標(biāo)準(zhǔn)中間使用液，氮?dú)獯蹈桑?0 mL正己烷溶解。取該溶液100μL注入液相色譜儀中進(jìn)行測定，測得保留時間為11.50 min。將500 μL待測液注入液相色譜儀中，在10.8～13.8 min收集餾分，氮?dú)獯蹈珊鬁?zhǔn)確加入1 mL甲醇，振蕩溶解，用于定量分析。

樣品凈化時，加入0.8%異丙醇可以調(diào)節(jié)維生素D3的保留時間，使之與干擾物分離。

1.4 凈化色譜條件

色譜柱為硅膠柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相為環(huán)己烷+正己烷（1+1，體積），并加入0.8%（體積分?jǐn)?shù)）異丙醇；流速1 mL/min；波長為264 nm；柱溫（35±1） ℃；進(jìn)樣體積500μL。

1.5 樣品定量分析色譜條件

色譜柱為C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相為甲醇+水（95+5，體積）；流速1 mL/min；檢測波長264 nm；柱溫（35±1） ℃；進(jìn)樣體積100μL。

2 結(jié)果

2.1 方法線性范圍

將濃度為0.02、0.04、0.08、0.16、0.20μg/mL的維生素D3標(biāo)準(zhǔn)系列工作液注入液相色譜儀中，標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖見圖1。測得標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的峰面積分別為5 921、12 125、24 294、48 652、61 703 mAU*min。以峰面積為縱坐標(biāo)，工作液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，維生素D3在0.02～0.20μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y＝308 429x－303.32，相關(guān)系數(shù)為0.9999。

2.2 添加回收率測定

采用外標(biāo)法定量時需要驗(yàn)證回收率能否滿足檢測要求。在已知維生素D3含量的樣品中分別加入維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品0.4μg、0.8μg、1μg，每個添加水平做6 次平行試驗(yàn)，經(jīng)與樣品相同步驟處理后測定維生素D3含量，計算添加回收率。3 個添加水平（0.4μg、0.8μg、1μg）的平均回收率（n=6）分別為85.26%、87.78%、90.01%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（n=6）分別是0.88%、1.01%、0.76%，表明本方法處理和凈化過程中維生素D3的損失少。

2.3 檢出限和定量限

當(dāng)稱樣量為2 g時，以3 倍信噪比（S/N）計算，維生素D3的檢出限為0.2μg/100 g，定量限為0.6 μg/100 g。

3 討論

圖1 維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

3.1 由于維生素D遇光照容易發(fā)生損失，樣品應(yīng)避光冷藏，盡快測定。樣品處理過程應(yīng)避免紫外光照，盡可能避光操作。測定過程使用的所有器皿不得含有氧化性物質(zhì)，分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油。

3.2 維生素D皂化過程對測定結(jié)果影響很大，要控制好皂化溫度和時間，一般皂化時間為30 min；如果皂化液冷卻后液面有浮油，需要加入適量氫氧化鉀溶液，并適當(dāng)延長皂化時間。

3.3 本方法回收率和重現(xiàn)性好，適合奶粉中維生素D3含量的測定。