孫曉巖 韓臨曉 陳博

近年來(lái), 臨床上加強(qiáng)了對(duì)基因多態(tài)性和同型半胱氨酸(Hcy)代謝、葉酸的研究, 但受研究方法與研究對(duì)象影響后,各研究結(jié)果均在不同程度上存在差異性［1,2］。本研究主要針對(duì)東莞市漢族女性MTHFR(hvlenetetrahvdrofolate reductase)和MTRR(methionine synthase reductas)的基因多態(tài)性分布特點(diǎn)進(jìn)行探究, 以此為該地區(qū)心腦血管疾病與出生缺陷預(yù)防方案的制定提供依據(jù), 報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2015年7月～2016年3月在東莞市第三人民醫(yī)院進(jìn)行備孕、孕前和孕期檢查的漢族女性718例為研究對(duì)象, 平均年齡(30.02±1.59)歲。所有女性均自愿簽署知情同意書(shū), 且均接受了口腔黏膜細(xì)胞采樣與遺傳檢驗(yàn), 將DNA抽提不符合要求的女性排除。

1. 2 方法 所有受檢者進(jìn)行空腹抽取外周靜脈血5 ml, DNA提取通過(guò)柱式抽提試劑盒進(jìn)行抽提, 提取結(jié)束后并進(jìn)行DNA濃度測(cè)定。MTRR A66G、MTHFR A1298C、MTHFR C677T的基因多態(tài)性采用Mass ARRAY技術(shù)進(jìn)行SNP分型檢測(cè), 利用MASS ARRAY的引物設(shè)計(jì)平臺(tái)設(shè)計(jì)PCR引物, 包括一對(duì)多重PCR擴(kuò)增引物及一條MASS EXTEND延時(shí)引物。然后進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng), 每個(gè)反應(yīng)體系總體積為5 μl, 1 μl包含濃度為 20 ng/μl的 DNA模板 , 1.8 μl無(wú)酶水 , 0.5 μl 10× PCR buffer, 0.4 μl 25 μM MgC12, 0.1 μl 25 μM dNTP Mix, 1 μl 0.5 μM Primer Mix, 0.2 μl 5 U/μl PCR Enzyme。設(shè)定反應(yīng)條件為：95℃2 min, 然后再完成20個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增(95℃30 s, 56℃ 30 s, 72℃1 min)與45個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。結(jié)束整個(gè)反應(yīng)過(guò)程之后得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)樹(shù)脂純化后在Nanodispenser Spectro CHIP芯片上點(diǎn)樣, 然后進(jìn)行Mass ARRAY 分析, 每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)只需3～5 s,全自動(dòng)分析, 通過(guò)TYPPER4.0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù), 采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算基因頻率, χ2檢驗(yàn)法完成等位基因頻率、基因型、Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn), 相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)采用95%可信區(qū)問(wèn)(CI)表示, α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2. 1 各地區(qū)基因型頻率與頻數(shù)對(duì)比 MTRR A66G、MTHFR A1298C、MTHFR C677T分別接受H-w遺傳平衡檢驗(yàn)之后,發(fā)現(xiàn)其均能和H-w平衡高度符合, 表示該樣本能夠有效代表本區(qū)域群體。本研究對(duì)東莞市漢族女性MTHFR、MTRR基因多態(tài)性分布情況與海南、德陽(yáng)、鄭州、濰坊等4個(gè)地方進(jìn)行對(duì)比, MTRR A66G的基因型構(gòu)成和海南對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 和德陽(yáng)、鄭州、濰坊對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 純合突變基因GG頻率低于海南(P＜0.05)；MTHFR A1298C基因型構(gòu)成和海南、德陽(yáng)對(duì)比, 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 和鄭州、濰坊對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 純合突變基因型CC高于鄭州、濰坊(P＜0.05)；東莞性MTHFR C677T基因型構(gòu)成和海南地區(qū)對(duì)比, 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 和德陽(yáng)、鄭州、濰坊對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),純合突變基因型TT頻率高于德陽(yáng), 低于鄭州、濰坊。見(jiàn)表1。

2. 2 各地區(qū)等位基因頻率與頻數(shù)對(duì)比 東莞市漢族女性MTHFR C677T突變等位基因頻率和德陽(yáng)對(duì)比, 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 低于海南, 高于鄭州、濰坊, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；MTHFR A1298C突變等位基因頻率和德陽(yáng)、海南對(duì)比, 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 高于濰坊、鄭州, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；MTRR A66G突變等位基因頻率和德陽(yáng)、鄭州、濰坊對(duì)比, 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 低于海南差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。濰坊、鄭州、德陽(yáng)、東莞和海南地區(qū)的MTHFR C677T突變等位基因頻率從北到南遞減。見(jiàn)表2。

表1 各地區(qū)基因型頻率與頻數(shù)對(duì)比［n(%)］

表2 各地區(qū)等位基因頻率與頻數(shù)對(duì)比［n(%)］

3 討論

妊娠期高血壓綜合征、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、先天性心臟病、唇腭裂、神經(jīng)管缺陷等疾病發(fā)展過(guò)程中, 血漿Hcy均具有十分重要的作用［3］。受到營(yíng)養(yǎng)因素與遺傳因素的共同作用之后, 便會(huì)促使血漿Hcy水平在一定程度上升高。葉酸代謝中, MTRR與MTHFR屬于兩種關(guān)鍵酶, 編碼酶活性、血漿Hcy濃度、血清和紅細(xì)胞葉酸濃度均會(huì)受到MTRR A66G、MTHFR C677T和MTHFR A1298C的影響。本研究中, 濰坊、鄭州、德陽(yáng)、東莞和海南地區(qū)的MTHFR C677T突變等位基因頻率從北到南遞減, 可知對(duì)MTRR與MTHFR進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查有利于我國(guó)深入化的研究出生缺陷病因?qū)W, 基因多態(tài)性地域分布差異在一定程度上反映了我國(guó)出生缺陷發(fā)病率南低北高情況。其次, 東莞市漢族女性具有自身獨(dú)特的MTHFR和MTRR基因多態(tài)性分布特點(diǎn), 為此, 制定健康干預(yù)方案時(shí), 應(yīng)該嚴(yán)格遵循“因人而異、因地制宜”的原則, 最大程度上對(duì)出生缺陷進(jìn)行有效預(yù)防［4-6］。

綜上所述, 東莞市漢族女性具有自身獨(dú)特的MTHFR和MTRR基因多態(tài)性分布特點(diǎn), 要根據(jù)該地區(qū)實(shí)際情況制定針對(duì)性的預(yù)防措施。