丙泊酚對(duì)人胃癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

胡微瀾，韓威利，杜增利

（1.河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.河南省焦作煤業(yè)集團(tuán)中央醫(yī)院，河南 焦作 454150）

胃癌作為常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，具有惡性程度高、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)、預(yù)后較差等特點(diǎn)[1]，目前，手術(shù)切除是胃癌最主要的治療手段[2]，但術(shù)后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而影響患者預(yù)后[3]。丙泊酚作為常用的全身麻醉類(lèi)藥物，具有麻醉誘導(dǎo)快，蘇醒迅速等優(yōu)點(diǎn)，是胃癌根除術(shù)的常用麻醉藥物[4]。有研究指出，丙泊酚在抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[5]。亦有研究指出，丙泊酚可抑制大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力[6]。本研究通過(guò)復(fù)制裸鼠人胃癌細(xì)胞皮下瘤模型，觀(guān)察丙泊酚對(duì)胃癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響，并探討可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

人胃癌細(xì)胞株SGC7901（中科院上海細(xì)胞生物化學(xué)研究所），30只清潔級(jí)級(jí)雌性BALB/c裸鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2012-00002]，4～5周齡，體重17～21 g，丙泊酚注射液（四川國(guó)瑞藥業(yè)有限責(zé)任公司）（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20040079），10%胎牛血清、胰酶、高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，總RNA提取試劑盒（Trizol法）（美國(guó)Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega公司），擴(kuò)增試劑盒（美國(guó)Axygen公司），核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2）、NAD（P）H醌氧化還原酶1[NAD（P）H-quinine oxidoreductase 1, NQO1]、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）、B淋巴細(xì)胞瘤（B-cell lymphoma-2c, Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein, Bax）及內(nèi)參引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成，兔抗鼠Nrf2多克隆抗體、兔抗人HO-1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，兔抗小鼠NQO1多克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體（上海滬峰化工公司），兔抗大鼠Bax多克隆抗體（武漢博士德生物公司），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）儀（美國(guó)ABI公司），凝膠電泳成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人胃癌細(xì)胞株SGC7901置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%二氧化碳CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胰酶消化后，每2、3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 復(fù)制裸鼠移植瘤模型及分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，用1 ml注射器將500μl細(xì)胞懸液注射于裸鼠右前肢皮下，之后放回籠中繼續(xù)進(jìn)行飼養(yǎng)。2周后皮下出現(xiàn)5 mm大小的結(jié)節(jié)為模型復(fù)制成功，30只裸鼠模型均復(fù)制成功。將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、生理鹽水組和丙泊酚組，每組10只。對(duì)照組未做任何處理；生理鹽水組腹腔注射生理鹽水1.5 ml/kg，1次/d，連續(xù)2周。丙泊酚組腹腔注射丙泊酚20 mg/kg，1次/d，連續(xù)2周。

1.2.3 觀(guān)察指標(biāo) 觀(guān)察各組裸鼠給藥前后身體變化，飲食、進(jìn)水及消瘦程度等一般情況，以及腹水、淋巴結(jié)腫大、消瘦等惡病質(zhì)發(fā)生情況。

1.2.4 移植瘤體積變化 給藥后每3 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算移植瘤體積，移植瘤體積（mm3）=1/2×長(zhǎng)徑×短徑2。第15天時(shí)將裸鼠脫臼處死，剝離瘤體，測(cè)量移植瘤體積，用電子天平稱(chēng)重，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=（對(duì)照組移植瘤平均體質(zhì)量-生理鹽水組或丙泊酚組移植瘤平均體質(zhì)量）/對(duì)照組移植瘤平均體質(zhì)量×100%[7]。

1.2.5 qRT-PCR 采用qRT-PCR檢測(cè)各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax基因的表達(dá)。取各組裸鼠移植瘤組織，研磨后加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，用總RNA提取試劑盒提取組織中總RNA，采用紫外分光光度法檢測(cè)總RNA的純度并定量。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為模板鏈cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR。引物序列：Nrf2正向引物：5’-ACACGGTCCACAGCTCATC-3’，反向引物：5’-TGTCAATCAAATCCATGTCCTG-3’；NQO1正向引物：5’-CAGAAATGACATCACAGGTGAGC-3’，反向引物：5’-CTAAGACCTGGAAGCCACAGAAA-3’；HO-1正向引物：5’- GCTCGAATGAACACTCTG GAGAT-3’，反向引物：5’-TCCAGAGAGAAAGGAA ACACAGG-3’；Bcl-2 正向引物：5’-CACAAGAGGCCA AGGCTACCT-3’，反向引物：5’-CAGGAAAGCAGG AAGTCTCAA-3’；Bax正向引物：5’-ATTGAGAAA CGATTTGCCTACA-3’，反向引物 ：5’-GGGAAAT GGCTTATTCTCCTTTGCTT-3’；β-actin正向引物：5’-TTGCCGACAGGATGCAGAAGGA-3’，反向引物：5’-AGGTGGACAGCGAGGCCAGGAT-3’。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1 min，92℃變性30 s，58℃退火30 s，73℃延伸30 s，共36個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-△△Ct法計(jì)算裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax基因相對(duì)表達(dá)量[8]。

1.2.6 Western blot檢測(cè) 采用Western blot檢測(cè)各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量。取各組裸鼠移植瘤組織，研磨后加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，用總蛋白提取試劑盒提取組織中總蛋白，用BCA總蛋白檢測(cè)試劑盒檢查總蛋白濃度。取30μg總蛋白，100℃變性后，進(jìn)行電泳分離，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，室溫下用脫脂奶粉封閉60 min。分別加入一抗兔抗鼠Nrf2多克隆抗體、兔抗小鼠NQO1多克隆抗體、兔抗人HO-1多克隆抗體、兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體及兔抗大鼠Bax多克隆抗體（稀釋比例分別為1∶1 000、1∶800、1∶1200、1∶500和1∶1 000），室溫下孵育120 min，4℃過(guò)夜孵育，加入二抗，室溫孵育60 min，加入ECL發(fā)光試劑后避光反應(yīng)25min，拍照。采用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析條帶灰度值，獲得各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析或單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布則采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組裸鼠一般情況

給藥后15 d，與丙泊酚組相比，對(duì)照組和生理鹽水組裸鼠出現(xiàn)進(jìn)水、飲食量顯著減少，體形消瘦明顯；對(duì)照組、生理鹽水組分別有4和3只裸鼠出現(xiàn)淺表淋巴結(jié)腫大，且移植瘤周?chē)霈F(xiàn)大小不等的衛(wèi)星癌灶。與給藥前相比，丙泊酚組裸鼠進(jìn)水正常，飲食量略有減少，體重稍減輕，未發(fā)生腹水或淋巴結(jié)腫大，移植瘤周?chē)匆?jiàn)衛(wèi)星癌灶。

2.2 各組裸鼠不同時(shí)間點(diǎn)移植瘤體積比較

丙泊酚組、對(duì)照組、生理鹽水組裸鼠給藥前，以及給藥后3、6、9、12和15 d時(shí)的移植瘤體積比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的移植瘤體積有差異（F=34.357，P=0.000）；②3組裸鼠移植瘤體積有差異（F=86.172，P=0.000），丙泊酚組的移植瘤體積小于對(duì)照組和生理鹽水組（P＜0.05）；③3組裸鼠移植瘤體積變化趨勢(shì)有差異（F=18.394，P=0.000）。見(jiàn)表 1。

2.3 各組裸鼠移植瘤體質(zhì)量和抑瘤率比較

丙泊酚組、對(duì)照組、生理鹽水組裸鼠移植瘤體質(zhì)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，丙泊酚組裸鼠移植瘤體質(zhì)量低于對(duì)照組和生理鹽水組（P＜0.05）。丙泊酚組、對(duì)照組、生理鹽水組抑瘤率比較，經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），丙泊酚組抑瘤率高于對(duì)照組。見(jiàn)表2。

表1 3組裸鼠各時(shí)間點(diǎn)移植瘤體積比較 （n =10，mm3，±s）

表1 3組裸鼠各時(shí)間點(diǎn)移植瘤體積比較 （n =10，mm3，±s）

注：?與對(duì)照組、與生理鹽水組比較，P ＜0.05

組別 給藥前 給藥后3 d 給藥后6 d 給藥后9 d 給藥后12 d 給藥后15 d對(duì)照組 54.2±14.8 143.4±35.0 282.4±57.3 439.6±65.9 621.8±70.2 863.5±78.3生理鹽水組 53.9±13.4 145.3±30.6 274.1±54.8 421.2±66.3 614.7±65.4 871.4±88.5丙泊酚組 54.8±15.3 98.3±23.7? 224.2±41.1? 351.6±55.1? 406.5±59.8? 512.6±70.8?

表2 各組裸鼠移植瘤體質(zhì)量和抑瘤率比較 （n =10）

2.4 各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax基因表達(dá)水平比較

丙泊酚組、對(duì)照組、生理鹽水組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，丙泊酚組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組和生理鹽水組（P＜0.05），而B(niǎo)ax mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組和生理鹽水組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平比較 （n =10，±s）

表3 各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平比較 （n =10，±s）

注：?與對(duì)照組、生理鹽水組比較，P ＜0.05

組別 Nrf2 mRNA NQO1 mRNA HO-1 mRNA Bcl-2 mRNA Bax mRNA對(duì)照組 1.92±0.13 1.58±0.12 1.69±0.13 1.84±0.17 1.14±0.16生理鹽水組 1.90±0.11 1.56±0.10 1.72±0.15 1.83±0.16 1.16±0.18丙泊酚組 1.28±0.14? 1.10±0.08? 1.17±0.10? 1.21±0.13? 1.75±0.14?F值 114.785 69.730 68.887 53.821 45.213 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.5 各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較

丙泊酚組、對(duì)照組、生理鹽水組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，丙泊酚組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組和生理鹽水組（P＜0.05），而B(niǎo)ax蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組和生理鹽水組（P＜0.05）。見(jiàn)表4和附圖。

表4 各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較 （n =10，±s）

表4 各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較 （n =10，±s）

注：?與對(duì)照組、生理鹽水組比較，P ＜0.05

組別 Nrf2蛋白 NQO1蛋白 HO-1蛋白 Bcl-2蛋白 Bax蛋白對(duì)照組 0.83±0.09 0.65±0.12 0.75±0.14 0.78±0.08 0.35±0.10生理鹽水組 0.84±0.11 0.67±0.14 0.76±0.12 0.80±0.11 0.34±0.09丙泊酚組 0.49±0.13? 0.29±0.08? 0.38±0.07? 0.42±0.13? 0.68±0.13?F值 30.585 23.466 58.075 42.889 15.610 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

附圖 各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)

3 討論

胃癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖、遷移及侵襲能力，這是導(dǎo)致胃癌進(jìn)展迅速、預(yù)后不良的重要原因[10]。有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，對(duì)提高療效、改善預(yù)后具有重要意義。胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲過(guò)程是多基因、多步驟共同作用的結(jié)果，其具體作用機(jī)制尚未完全清楚。

丙泊酚是臨床上常用的麻醉類(lèi)藥物，具有良好的麻醉誘導(dǎo)和維持效果，常用于腫瘤根治性手術(shù)[11]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚具有一定的抗腫瘤作用[12]。白建杰等[13]指出，丙泊酚可下調(diào)人乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞中H19的表達(dá)而抑制細(xì)胞遷移、侵襲過(guò)程。賴(lài)曉紅等[14]亦采用離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，丙泊酚可通過(guò)抑制RhoA/ROCK1信號(hào)通路，降低人胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。張健[15]指出，丙泊酚可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。本研究利用人胃癌細(xì)胞株SGC7901復(fù)制裸鼠胃癌移植瘤，結(jié)果顯示，丙泊酚組裸鼠給藥后3、6、9、12和15 d時(shí)移植瘤體積均低于對(duì)照組和生理鹽水組，說(shuō)明丙泊酚可抑制裸鼠移植瘤生長(zhǎng)；15 d時(shí)將3組裸鼠處死，對(duì)移植瘤進(jìn)行稱(chēng)重，結(jié)果丙泊酚組裸鼠移植瘤體質(zhì)量降低，而抑瘤率升高，說(shuō)明丙泊酚具有抗胃癌移植瘤生長(zhǎng)的作用，在抑制胃癌移植瘤生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。

Nrf2作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵性因子，在調(diào)控氧化還原平衡、細(xì)胞代謝、增殖及凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2可與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element, ARE）結(jié)合，啟動(dòng)多種解毒酶、抗氧化基因的表達(dá)，如HO-1、NQO1等，保護(hù)細(xì)胞免于受損[17]。也有研究表明，Nrf2/ARE通路參與多種腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移過(guò)程，是重要的抗腫瘤治療靶位[18]。有研究指出，下調(diào)Nrf2和下游靶基因的表達(dá)可抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[19]。應(yīng)鎮(zhèn)光等[20]指出，Nrf2/ARE信號(hào)通路參與胃癌發(fā)生及耐藥性的產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組和生理鹽水組相比，丙泊酚組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，說(shuō)明丙泊酚可能通過(guò)抑制Nrf2/ARE信號(hào)通路而發(fā)揮抗腫瘤作用。

Bcl-2和Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因，Bcl-2可保護(hù)細(xì)胞避免凋亡，Bax則在促進(jìn)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[21]。本研究結(jié)果顯示，丙泊酚組裸鼠移植瘤組織中Bcl-2基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，而B(niǎo)ax基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，說(shuō)明丙泊酚促進(jìn)移植瘤組織細(xì)胞凋亡的發(fā)生。筆者推測(cè)丙泊酚可能通過(guò)抑制Nrf2/ARE信號(hào)通路及下游保護(hù)性基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，丙泊酚可抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能與抑制Nrf2/ARE信號(hào)通路，而促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。