陳月月，王凱，王舒豐，姚曉慧，軒慧勇，馬木爾，夏利寧

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.霍城縣職業(yè)技術(shù)學(xué)校，新疆伊犁 835200)

0 引 言

【研究意義】獸醫(yī)臨床中致病性大腸桿菌常感染動(dòng)物胃腸道，通過(guò)黏膜進(jìn)入血液引起不同的疾病[1]，其危害嚴(yán)重，特別體現(xiàn)在禽類養(yǎng)殖業(yè)，給養(yǎng)殖戶造成較大的經(jīng)濟(jì)損失?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大腸桿菌病的防治主要依靠抗菌藥物，因此，抗菌藥物在治療大腸桿菌病中有著無(wú)法替代的作用，但隨著抗菌藥物種類逐漸多樣化和不規(guī)范的使用，導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)很多藥物產(chǎn)生耐藥，甚至是多重耐藥[2-3]。雖然世界上多個(gè)國(guó)家和組織都在不斷研發(fā)新的抗菌藥物來(lái)對(duì)抗細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題，但耐藥菌的產(chǎn)生速度遠(yuǎn)比研發(fā)新藥速度快很多?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】新疆晝夜溫差大，動(dòng)物易發(fā)病，而大腸桿菌作為一種條件性致病菌，給養(yǎng)殖帶來(lái)潛在的威脅，鮮見對(duì)新疆伊犁地區(qū)不同動(dòng)物源大腸桿菌耐藥性調(diào)查的報(bào)道。調(diào)查研究新疆伊犁地區(qū)不同動(dòng)物源大腸桿菌耐藥性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用瓊脂稀釋法，對(duì)新疆伊犁地區(qū)集約化養(yǎng)殖豬、散養(yǎng)養(yǎng)殖牛、羊、雞糞源大腸桿菌進(jìn)行耐藥性調(diào)查，提高臨床治療效果的同時(shí)降低耐藥菌產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集

2016年10月在新疆伊犁地區(qū)霍城縣采集糞樣798份，其中包括牛糞樣189份(1.5～2歲齡)、羊糞樣200份(1～1.5歲齡)、雞糞樣300份(5～7月齡)和豬糞樣100份(7～10月齡)，從中分離試驗(yàn)用大腸桿菌。

1.1.2 菌株和培養(yǎng)基

大腸桿菌ATCC25922標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。麥康凱培養(yǎng)基、普通肉湯和Mueller-Hinton(MH)培養(yǎng)基均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 藥品

喹諾酮類：環(huán)丙沙星(含量100%)、諾氟沙星(含量99.6%)和恩諾沙星(含量100%)；氨基糖苷類：安普霉素(含量55.8%)、阿米卡星(含量65.5%)和慶大霉素(含量54.6%)；β-內(nèi)酰胺類：阿莫西林(含量86.6%)/克拉維酸(含量100%)、頭孢噻呋(含量100%)和氨芐西林(含量86.5%)；酰胺醇類：氟苯尼考(含量98%)。上述藥物標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.2 方 法

1.2.1 大腸桿菌分離鑒定

用滅菌棉簽輕插入動(dòng)物的肛門內(nèi)，將沾有糞樣的棉簽放入內(nèi)含1 mL滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的EP管中，37℃恒溫培養(yǎng)12 h，將樣液用接種環(huán)在麥康凱瓊脂平板上劃線，倒置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)18～24 h后，平板上生長(zhǎng)出一致的粉紅色菌落，挑取單菌落，經(jīng)革蘭氏染色及生化鑒定后，將確定為大腸桿菌的用滅菌含量為60%的甘油保菌，于-20℃冰箱保存。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)

按照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(clinical and laboratory standards institute，CLSI)[4]推薦的瓊脂稀釋法來(lái)進(jìn)行，對(duì)分離的大腸桿菌進(jìn)行上述10種抗菌藥物最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)的測(cè)定，以大腸桿菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株，結(jié)果判定參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)以敏感、中介和耐藥3種形式記錄。表1

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌分離鑒定

四種動(dòng)物源的大腸桿菌分離情況為，大腸桿菌分離率由高到低依次為羊源大腸桿菌(100%)、雞源大腸桿菌(90.0%)、豬源大腸桿菌(89.0%)和牛源大腸桿菌(82.8%)。表2

表1 10種抗菌藥物及ATCC25922質(zhì)控范圍的MICs結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 MICs results determination standard of 10 antibacterial agents and ATCC25922 quality control range(μg/mL)

表2 不同動(dòng)物源大腸桿菌的分離率Table 2 The rate of Escherichia coli isolated from feces of different animals

2.2 不同動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)10種抗菌藥物的耐藥情況

不同動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)10種常見的抗菌藥物的耐藥結(jié)果為，豬源大腸桿菌對(duì)被檢抗菌藥物存在不同程度的耐藥，尤其對(duì)氨芐西林(66.0%)、阿莫西林/克拉維酸(64.0%)、氟苯尼考(64.0%)和恩諾沙星(53.0%)4種抗菌藥物，耐藥率均超過(guò)50%；而對(duì)阿米卡星(100%)、安普霉素(92.0%)和頭孢噻呋(91.0%)的敏感率均在90%以上。圖1

牛源大腸桿菌對(duì)被檢抗菌藥物具有較好的敏感性，對(duì)安普霉素耐藥率最高，僅為26.8%；對(duì)阿米卡星(98.8%)、氟苯尼考(95.1%)、環(huán)丙沙星(94.5%)、諾氟沙星(94.5%)、氨芐西林(91.5%)和恩諾沙星(91.4%)的敏感率均在90%以上，對(duì)頭孢噻呋(100%)和慶大霉素(100%)完全敏感。圖2

羊源大腸桿菌對(duì)阿莫西林/克拉維酸(77.5%)和氨芐西林(69.5%)2種抗菌藥物的耐藥率超過(guò)50%；對(duì)恩諾沙星(37.0%)和諾氟沙星(27.5%)的中介率相對(duì)較高；對(duì)阿米卡星(100%)、頭孢噻呋(96.0%)、慶大霉素(72.5%)、氟苯尼考(65.5%)、環(huán)丙沙星(60.0%)和安普霉素(56.5%)6種抗菌藥物的敏感率在55%以上。圖3

圖1 豬源大腸桿菌耐藥情況
Fig.1 Resistance rate of Escherichia coli isolated from feces of piglets

圖2 牛源大腸桿菌耐藥情況
Fig.2 Resistance rate of Escherichia coli isolated from feces of cattle

圖3 羊源大腸桿菌耐藥情況
Fig.3 Resistance rate of Escherichia coli isolated from feces of sheep

雞源大腸桿菌對(duì)氨芐西林(74.4%)、阿莫西林/克拉維酸(73.0%)、氟苯尼考(71.7%)、恩諾沙星(65.9%)和諾氟沙星(61.1%)5種抗菌藥物耐藥率超過(guò)60%；但對(duì)阿米卡星(92.6%)、安普霉素(74.8%)、慶大霉素(69.6%)和頭孢噻呋(66.7%)這4種抗菌藥物的敏感率在66%以上。圖4

2.3 不同動(dòng)物源大腸桿菌多藥耐藥情況

不同動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)臨床常用抗菌藥物多藥耐藥情況：牛源大腸桿菌多藥耐藥集中在0～5耐之間，以0耐(62.0%，102/164)和1耐(32.0%，52/164)為主，2耐、4耐和5耐的多藥耐藥百分比分別為1.0%、4.0%和1.0%；羊源大腸桿菌多藥耐藥在0～8耐分布，以4耐(16.0%，32/200)和6耐(16.0%，32/200)為主，其次是3耐(15.5%)和5耐(12.5%)；豬源大腸桿菌在0～8耐有分布，以0耐(16.0%，14/89)和5耐(13.0%，12/89)為主，其次是2耐(12.0%)、3耐(11.0%)、4耐(10.0%)和6耐(12.0%)；雞源大腸桿菌多藥耐藥在0～10耐均有分布，以6耐(15.2%，41/270)和7耐(17.7%，48/270)為主，其次是8耐(14.4%)。圖5

圖4 雞源大腸桿菌耐藥情況
Fig.4 Resistance rate of Escherichia coli isolated from feces of chicken

圖5 不同動(dòng)物源大腸桿菌多藥耐藥情況
Fig.5 Comparison of multidrug resistance rates of Escherichia coli isolated from feces of different animals

3 討 論

3.1 不同動(dòng)物源大腸桿菌耐藥情況

3.1.1 豬源大腸桿菌耐藥情況比較

此次試驗(yàn)中豬源大腸桿菌對(duì)阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林、氟苯尼考這3種抗菌藥物的耐藥百分率均超過(guò)60%，高于王基偉等[5]報(bào)道的豬源大腸桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥率為52.7%；但耐藥結(jié)果低于岳秀英等[6]與張炳亮等[7]報(bào)道的豬源大腸桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥率，耐藥率分別是91.2%和94.1%。不同地區(qū)豬源大腸桿菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥情況差異較大，如魏雅靜[8]報(bào)道的四川省不同地區(qū)大腸桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥率為74.6%；黃健強(qiáng)等[9]報(bào)道的粵北地區(qū)仔豬腹瀉大腸桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥率為85%，恩諾沙星的耐藥率為67.5%；艾偉昌等[10]河南省豬源大腸桿菌對(duì)氨芐西林與氟苯尼考耐藥率分別為85.4%和83.0%。豬源大腸桿菌耐藥性日益嚴(yán)重，原因可能是因?yàn)樨i疾病較多，特別在養(yǎng)殖過(guò)程中容易得大腸桿菌病，在治療過(guò)程中使用抗菌藥物多樣化，導(dǎo)致豬源大腸桿菌耐藥性復(fù)雜。

3.1.2 牛源大腸桿菌耐藥情況

牛源大腸桿菌對(duì)被檢抗菌藥物耐藥性幾乎呈現(xiàn)敏感，對(duì)安普霉素耐藥率最高，為26.8%，耐藥率比軒慧勇等[11]報(bào)道的奎屯地區(qū)牛源大腸桿菌耐藥率安普霉素(13.3%)高。牛作為一種大型的畜牧養(yǎng)殖動(dòng)物，耐受性較好，一般能夠以自身的免疫系統(tǒng)抵制疾病，就目前狀況來(lái)看，本地區(qū)牛源大腸桿菌耐藥情況不嚴(yán)重，但也不能輕視。

3.1.3 羊源大腸桿菌耐藥情況

羊源大腸桿菌與豬源大腸桿菌耐藥情況大體相同，主要對(duì)阿莫西林/克拉維酸和氨芐西林耐藥，耐藥率分別為77.5%和69.5%，耐藥結(jié)果稍高于南海辰等[12]報(bào)道的羊源大腸桿菌對(duì)阿莫西林/克拉維酸(33.3%)與氨芐西林(45.8%)的耐藥率，但耐藥結(jié)果與劉正明等[13]報(bào)道的內(nèi)蒙古羊源大腸桿菌對(duì)阿莫西林/克拉維酸耐藥率(75%)大致相同。由于羊的樣本采集較為困難，且缺少大型規(guī)?；蝠B(yǎng)殖場(chǎng)，所以國(guó)內(nèi)鮮見對(duì)羊大腸桿菌耐藥性的研究，但試驗(yàn)結(jié)果顯示，新疆伊犁地區(qū)羊源大腸桿菌對(duì)臨床常用部分抗菌藥物耐藥結(jié)果嚴(yán)重，通過(guò)用藥調(diào)查發(fā)現(xiàn)：養(yǎng)殖戶或農(nóng)牧民在應(yīng)對(duì)羊大腸桿菌病時(shí)，也曾使用過(guò)較多抗菌藥物進(jìn)行治療。因此，羊源大腸桿菌耐藥性應(yīng)該得到重視。

3.1.4 雞源大腸桿菌耐藥情況

試驗(yàn)雞源大腸桿菌耐藥性較為復(fù)雜，主要對(duì)氨芐西林(74.4%)、阿莫西林/克拉維酸(73.0%)、氟苯尼考(71.7%)、恩諾沙星(65.9%)和諾氟沙星(61.1%)5種抗菌藥物耐藥。其中氨芐西林與阿莫西林耐藥率較高于李穗霞等[14]肉雞源對(duì)阿莫西林/克拉維酸(66.0%)和氨芐西林(60.6%)的報(bào)道；與王影等[15]報(bào)道的雞源大腸桿菌對(duì)氨芐西林(77.7%)耐藥率相似，但氟苯尼考(55.6%)的耐藥率略低于本試驗(yàn)；而本試驗(yàn)結(jié)果低于方杰[16]報(bào)道的雞源大腸桿菌對(duì)氨芐西林(80.9%)與恩諾沙星(90.1%)的耐藥率。以上報(bào)道顯示，雖然不同地區(qū)雞源大腸桿菌耐藥結(jié)果存在差異，但均對(duì)被檢臨床抗菌藥物耐藥情況嚴(yán)重。雞作為人類生活當(dāng)中必不可少的禽類養(yǎng)殖動(dòng)物，隨著人類對(duì)雞以及雞產(chǎn)品需求量越來(lái)越大，雞養(yǎng)殖也由散養(yǎng)進(jìn)入集約化養(yǎng)殖，集約化養(yǎng)殖存在密度較大的原因，導(dǎo)致在雞養(yǎng)殖過(guò)程中容易得大腸桿菌病，而雞肉與雞產(chǎn)品要求飼養(yǎng)周期短，所以在雞大腸桿菌臨床用藥方面呈現(xiàn)多樣化，耐藥情況也越來(lái)越嚴(yán)重。

3.2 不同動(dòng)物源多藥耐藥情況比較與分析

試驗(yàn)中牛源大腸桿菌多藥耐藥情況主要以0耐和1耐為主，與軒慧勇等[11]與南海辰等[12]報(bào)道的多藥耐藥結(jié)果大致相同，分離的豬源大腸桿菌與羊源大腸桿菌在0～8耐分布；但雞源大腸桿菌在0～10耐均有分布，此次試驗(yàn)結(jié)果與賴婧等[17]報(bào)道的大腸桿菌多藥耐藥情況相比較為嚴(yán)重，但與邢艷蘋等[18]多藥耐藥結(jié)果大致相似。以上研究結(jié)果表明，全國(guó)各地的不同動(dòng)物源大腸桿菌都具有不同程度的耐藥情況，其中對(duì)青霉素類和酰胺醇類抗菌藥物的耐藥率較高。

雞源270株大腸桿菌對(duì)臨床常用10種抗菌藥物存在不同程度的多藥耐藥情況，多藥耐藥情況最為嚴(yán)重，分析原因可能為：雞作為高密度和集中飼養(yǎng)的典范，在養(yǎng)殖過(guò)程中長(zhǎng)期持續(xù)利用抗生素預(yù)防和治療疾病，特別是該地區(qū)雞養(yǎng)殖戶在應(yīng)對(duì)雞的大腸桿菌病時(shí)，抗生素濫用情況突出；由于養(yǎng)殖場(chǎng)和獸醫(yī)臨床大量使用抗生素，大腸桿菌耐藥譜逐漸擴(kuò)大，耐藥率逐漸上升，原本對(duì)大腸桿菌病治療有效的抗菌藥物療效明顯下降甚至喪失[19]，細(xì)菌在用藥壓力下可通過(guò)改變自身的代謝途徑或耐藥基因的突變，避免被藥物抑制或殺滅，從而產(chǎn)生獲得耐藥性[20]。

4 結(jié) 論

新疆伊犁地區(qū)不同動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)臨床常用抗菌藥物存在不同程度耐藥，整體耐藥情況由高到低依次為雞源大腸桿菌>豬源大腸桿菌>羊源大腸桿菌>牛源大腸桿菌；除牛源菌外，對(duì)氨芐西林和阿莫西林/克拉維酸耐藥率超過(guò)64.0%，不同動(dòng)物源分離的大腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢噻呋、阿米卡星和慶大霉素有較好的敏感性。在進(jìn)行該地區(qū)大腸桿菌病臨床用藥時(shí)，可結(jié)合此根據(jù)不同動(dòng)物源耐藥情況合理用藥，防止短期內(nèi)耐藥性與多藥耐藥的現(xiàn)象加重。