陳宛麗，關(guān)紅梅，王 舒

(南陽市第二人民醫(yī)院 血液科, 河南 南陽 473000)

霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma, HL)為淋巴系統(tǒng)的惡性實(shí)體瘤之一[1]，其特征是瘤組織內(nèi)含有特異性的R-S(Reed-Sternberg)細(xì)胞，并常伴有多量炎性細(xì)胞反應(yīng)[2]。盡管部分霍奇金淋巴瘤治愈率高，但仍存在一些難治性患者，需要使用其他藥物來治療這些患者。

硼替佐米(Bortezomib)是哺乳動物細(xì)胞中26S蛋白酶體可逆抑制劑，主要用于多發(fā)性骨髓瘤的治療[3]，也用于非霍奇金淋巴瘤的治療[4]，但是用于霍奇金淋巴瘤的治療報(bào)道較少。本研究通過探究不同劑量硼替佐米對細(xì)胞系L428形態(tài)、細(xì)胞凋亡的影響，并探討可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系L428(武漢普諾賽細(xì)胞庫)；硼替佐米(西安楊森制藥有限公司)；MTT細(xì)胞活力試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒、Hoechst33258試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天生物有限公司)；Bax、Bcl-2、cleaved casepase-3、β-actin抗體(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及處理：將霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系L428培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為對照組(control)和不同濃度硼替佐米組(分別給予10、30和50 nmol/L硼替佐米處理24 h)。

1.2.2 MTT檢測細(xì)胞活力：將L428細(xì)胞以5×103個/mL鋪于96孔板上，用硼替佐米處理后，按照說明書進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，并在酶標(biāo)儀540 nm處讀取各孔的吸光值(A)。

1.2.3 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)：將L428細(xì)胞以5×103個/mL鋪于96孔板上，用10 nmol/L硼替佐米處理24 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 Hoechst33258染核：將L428細(xì)胞5×103個/mL鋪于在96孔板中，用硼替佐米處理后，按照說明書進(jìn)行Hoechst33258染核操作，熒光顯微鏡下檢測，檢測條件激發(fā)光波長為380 nm，發(fā)射波長為420 nm。

1.2.5 一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡：將L428細(xì)胞5×103個/mL鋪于在96孔板中，用硼替佐米處理后，按照說明書進(jìn)行TUNEL染色操作，并在熒光酶標(biāo)儀激發(fā)波長450 nm和發(fā)射波長565 nm處讀取各孔的熒光值，并根據(jù)說明書計(jì)算TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測細(xì)胞凋亡：將L428細(xì)胞以5×105個/mL接種于24孔板中，用硼替佐米處理后，收集細(xì)胞；按照說明書進(jìn)行Annexin V-FITC/PI進(jìn)行染色操作，進(jìn)行流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，檢測條件激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm。

1.2.7 Western blot檢測蛋白水平：冰上萃取蛋白，調(diào)整蛋白濃度進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉40 min，室溫孵育一抗Bax、Bcl-2和cleaved casepase-3(1∶2 000稀釋) 2 h，洗膜3次，室溫孵育相應(yīng)二抗(1∶2 000稀釋) 1 h，洗膜3次。自動顯影儀顯影，并采用Image J分析條帶吸光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 硼替佐米對L428細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

與對照組相比，加入10 nmol/L硼替佐米培養(yǎng)24 h后，L428細(xì)胞出現(xiàn)拉絲、稀疏現(xiàn)象(圖1A)；硼替佐米處理后的細(xì)胞核出現(xiàn)不同程度的固縮，出現(xiàn)凋亡的熒光小體(圖1B)。

2.2 硼替佐米對L428細(xì)胞活力的影響

與對照組相比，硼替佐米濃度依賴性抑制L428細(xì)胞活力(P<0.05)(圖2)。

2.3 硼替佐米對L428細(xì)胞凋亡的影響

與對照組相比，硼替佐米濃度依賴性促進(jìn)L428細(xì)胞凋亡(P<0.05)(圖3)。

2.4 硼替佐米對L428細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

加入硼替佐米培養(yǎng)L428細(xì)胞后，cleaved caspase-3蛋白水平呈濃度依賴性上調(diào)(P<0.05)(圖4)。

A.L428 cell morphology of inverted microscope; B.Nuclear morphology of Hoechst33258 staining圖1 硼替佐米對L428細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響Fig 1 Effect of Bortezomib on L428 cell morphology

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with 10 nmol/L; △P<0.05 compared with 30 nmol/L圖2 硼替佐米濃度依賴性抑制L428細(xì)胞活力Fig 2 Bortezomib inhibited L428 cell viability in a dose-

2.5 硼替佐米對L428細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

加入硼替佐米培養(yǎng)L428細(xì)胞后，Bcl-2蛋白水平呈濃度依賴性下調(diào)(P<0.05)；Bax蛋白水平呈濃度依賴性上調(diào)(P<0.05)(圖5)。

3 討論

大部分霍奇金淋巴瘤患者通過常規(guī)化療可以治愈，但仍存在一些復(fù)發(fā)性患者或者難治性患者[5]，需要使用其他藥物來治療這些患者。文獻(xiàn)報(bào)道硼替佐米能通過激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡[6]，近來同樣發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞凋亡[7]，但在霍奇金淋巴瘤的治療報(bào)道較少。因此，開發(fā)其他藥物對霍奇金淋巴瘤治療具有重大意義。在本實(shí)驗(yàn)中，首先用MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，硼替佐米能濃度依賴性抑制L428細(xì)胞活力，進(jìn)一步采用Annexin V-FITC/PI染色和TUNEL染色，發(fā)現(xiàn)硼替佐米能濃度依賴性誘導(dǎo)L428細(xì)胞凋亡。同時Hoechst 33258熒光染色，發(fā)現(xiàn)硼替佐米誘導(dǎo)L428細(xì)胞凋亡同時出現(xiàn)了細(xì)胞核固縮和凋亡小體形成。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的過程，其中Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡中起到重大作用[8]。Bcl-2家族由抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w等)和促凋亡蛋白(Bax、Bit、Bim等)組成[9]。在凋亡過程中，Bcl-2降解，胞質(zhì)Bax轉(zhuǎn)位至線粒體膜，增加通透性，釋放細(xì)胞色素C，最終激活caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10-12]。因此，本研究采用Western blot觀察了硼替佐米對L428細(xì)胞Bcl-2和bax的影響，發(fā)現(xiàn)Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax上調(diào)，且檢測到caspase-3的切割片段，故結(jié)合以上結(jié)果及文獻(xiàn)分析，提示硼替佐米可能通過下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bax轉(zhuǎn)位，從而引起線粒體外膜通透性增加，caspase-3激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

A.representative images and statistical analysis of Annexin V-FITC/PI staining; B.statistical analysis of TUNEL staining;*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with 10 nmol/L;△P<0.05 compared with 30 nmol/L

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with 10 nmol/L;△P<0.05 compared with 30 nmol/L

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with 10 nmol/L; △P<0.05 compared with 30 nmol/L圖5 Western blot檢測硼替佐米對細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響Fig 5 Effect of Bortezomib on the protein expressions of Bcl-2 and Bax detected by Western