馬博昭，王小東，王金淼，戚 峰

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院普通外科，天津300052）

近年來腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用被越來越多的人認(rèn)識，腫瘤微環(huán)境由多種細(xì)胞成分構(gòu)成，包括腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及間充質(zhì)細(xì)胞。在這種異質(zhì)性環(huán)境中，CAFs是最主要的細(xì)胞，在腫瘤進(jìn)展、侵襲及遷移過程中起著重要的作用[1]。有些研究認(rèn)為CAFs在大多數(shù)的腫瘤中通過分泌多種細(xì)胞因子如TGF-β、IL-6等從而起到促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用[2-3]。吡非尼酮（PFD）是一個有效的抗纖維化藥物，很多研究已經(jīng)證實，吡非尼酮可以改變成纖維細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子及生長因子[4-7]。本研究旨在探討吡非尼酮在結(jié)腸癌CAFs誘導(dǎo)的HT29結(jié)腸癌細(xì)胞系侵襲、增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）中的作用及機(jī)制，為結(jié)腸癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料 人結(jié)腸癌源性腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞系（江蘇齊氏生物公司），人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29（本實驗室保存）。

1.1.2 主要試劑 CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所），吡非尼酮 （adamas-beta公司），2×RT MasterMix及總RNA提取試劑盒（天根生物科技（北京）有限公司）；高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Select Master Mix（Invitrogen公司，美國）；E-cadherin、Vimentin、β-actin 單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔抗體（Cell Signaling TechnologY，美國）；Western blot發(fā)光液（Millipore公司，美國），TGF-β1、IL-6細(xì)胞因子 ELISA 試劑盒（北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 篩選藥物濃度 結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29以5×103個/孔接種于96孔板，吡非尼酮以0、0.25、0.5 mg/mL不同濃度分別培養(yǎng)HT29細(xì)胞，每組10個復(fù)孔，培養(yǎng) 72 h，加入 10 μL CCK8 溶液，37℃孵育 1 h，450nm處檢測吸光度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 在以下幾種條件下培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29：含10%FBS的DMEM標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)（control）；含 0.5 mg/mL吡非尼酮（PFD）培養(yǎng)基培養(yǎng)（PFD-CM）；CAFs上清條件培養(yǎng)（CAF-CM）；加入吡非尼酮（PFD）處理CAFs細(xì)胞后的條件培養(yǎng)（PFD-CAF-CM）。

1.2.3 CCK8實驗 結(jié)腸癌細(xì)胞HT29以5×104個/孔接種于 24 孔板，Transwell上室以 1×104個/室接種CAF細(xì)胞。分為3個對照組：標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)（control），CAFs與 HT29 Transwell共培養(yǎng) （CAF-CM）；含0.5 mg/mL PFD的培養(yǎng)基CAFs與HT29 Transwell共培養(yǎng)（PFD-CAF-CM）。每組4個復(fù)孔，培養(yǎng)60 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入10%CCK8溶液500 μL，37℃孵育40 min，每個復(fù)孔吸出100 μL置于96孔板，450 nm處檢測吸光度。

1.2.4 Transwell實驗

1.2.4.1 Transwell侵襲實驗：Matrigel膠1:6稀釋后以50 μL包被Transwell上室底部膜，在Transwell下室內(nèi)加入含10%FBS細(xì)胞培養(yǎng)基600 μL，上室內(nèi)加入各組細(xì)胞的無胎牛血清培養(yǎng)基懸浮液200 μL，上室內(nèi)加入各組處理后的HT29細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)為1×105，37℃培養(yǎng)24 h后，用棉簽拭去Matrigel膠，將Transwell上室置于4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，倒置顯微鏡下計數(shù)移至微孔膜下層每視野的細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)計數(shù)5個高倍視野，求平均值。

1.2.4.2 Transwell遷移實驗：在Transwell下室中加入含10%FBS的培養(yǎng)基600 μL，在上室中加入各組處理后的HT29細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)目為1×105個/室，細(xì)胞懸液體積200 μL，37℃培養(yǎng)12 h，用棉簽拭去小室上面細(xì)胞，將Transwell上室置于4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，倒置顯微鏡下計數(shù)移至微孔膜下層每視野的細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)計數(shù)5個高倍視野，求平均值。

1.2.5 ELISA 取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，按每孔3×104個細(xì)胞種于24孔板，置于37℃，待細(xì)胞貼壁后以 0、0.25、0.5、1.0、1.5 mg/mL 吡非尼酮濃度加藥，每組3個復(fù)孔。提取細(xì)胞上清，采用ELISA法檢測IL-6、TGF-β1的分泌量。

1.2.6 RT-PCR及 Western blot檢測 HT29細(xì)胞Vimentin、E-cadherin表達(dá)水平Trizol法分別提取結(jié)腸癌細(xì)胞各組中總RNA，需測定基因引物序列，E-cadherin，上游：5′-CCTGGGACTCCACCTACAGA-′，下游：5′-TGGATTCCAGAAACGGAGGC-3′（擴(kuò)增片段長度 196 bp）；Vimentin 上游：5′-CCGGGAGAAA TTGCAGGAGGAG-3′，下游：5′-CGGGCTTTGTCG TrGGTTAG-3′(擴(kuò)增片段長度 178 bp)；GAPDH（內(nèi)參基因），上游：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游：5′-AGGTCAAGACGTGCCAGAGAC-3′，2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達(dá)量，采用蛋白印跡法（Western blot）檢測Vimentin和E-cadherin基因蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 運用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD法，所有統(tǒng)計結(jié)果以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義標(biāo)準(zhǔn)。每個實驗均進(jìn)行了3次獨立實驗。

2 結(jié)果

2.1 藥物濃度篩選結(jié)果 結(jié)腸癌細(xì)胞HT29接種于96孔板，吡非尼酮以0、0.25、0.5 mg/mL不同濃度分別培養(yǎng)HT29細(xì)胞，培養(yǎng)72 h，CCK8試劑檢測吸光度。統(tǒng)計結(jié)果顯示0.25、0.5 mg/mL均對HT29細(xì)胞增殖無抑制作用（P＞0.05），選取0.5 mg/mL作為PFD-CAF-CM組藥物濃度（表1）。

表1 各組細(xì)胞吸光度Tab 1 The absorbency in each group

2.2 CCK8實驗檢測增殖作用 PFD-CAF-CM組分別與對照組、CAF-CM組比較增殖效率受抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明PFD可以抑制CAFs與HT29協(xié)同增殖作用；對照組與CAF-CM組比較無明顯差異（P＞0.05）（圖 1，表2）。

圖 1CCK8檢測增殖作用Fig 1 CCK8 detection of proliferation

表2 CCK8檢測增殖作用Tab 2 CCK8 detection of proliferation

2.3 Transwell實驗

2.3.1 Transwll侵襲實驗 CAF-CM組與PFDCM、PFD-CAF-CM組、對照組相比，侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明CAF使HT29細(xì)胞侵襲性增強；PFD-CM組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明PFD不影響HT29細(xì)胞侵襲能力；PFD-CAF-CM組與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明PFD可以抑制CAF對HT29細(xì)胞侵襲能力的影響（圖2，表3）。

圖2 各組細(xì)胞侵襲結(jié)果Fig 2 The invasion results of each cell line in each group

表3 各組細(xì)胞侵襲/遷移結(jié)果Tab 3 The invasion/migration results of each cell lines in each group

2.3.2 Transwell遷移實驗 CAF-CM組與PFDCAF-CM組、對照組相比，遷移細(xì)胞數(shù)目明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明CAF使HT29細(xì)胞遷移能力增強；PFD-CM組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明PFD不影響HT29細(xì)胞遷移能力；PFD-CAF-CM組與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明PFD可以抑制CAF對HT29細(xì)胞遷移能力的影響（圖3，表3）。

2.4 ELISA實驗檢測PFD對CAFs分泌TGF-β1、IL-6因子的作用 經(jīng)0.25、0.5、1.0、1.5 mg/mL吡非尼酮藥物干預(yù)后，CAFs分泌TGF-β1顯著減少，且隨PFD劑量增加TGF-β1濃度遞減，各組與對照組比較差異顯著（P＜0.01），說明PFD抑制CAFs分泌TGF-β1且存在劑量依賴關(guān)系（表4，圖4）。不同藥物濃度組IL-6含量無明顯差異。

圖3 各組細(xì)胞遷移結(jié)果Fig 3 The migration results of each cell line in each group

表4 ELISA檢測TGF-β1Tab 4 ELISA detection of TGF-β1

圖4 ELISA檢測TGF-β1Fig 4 ELISA detection of TGF-β1

2.5 RT-PCR及Western blot檢測HT29細(xì)胞Vimentin、E-cadherin表達(dá)水平 與對照組、PFDCM組和PFD-CAF-CM組比較，CAF-CM組Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；PFD-CM組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明PFD不影響HT29細(xì)胞Vimentin、E-cadherin表達(dá)；對照組和PFD-CAF-CM組比較Vimentin的mRNA和蛋白及E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)水平無顯著性差異（P＞0.05），說明PFD可以抑制CAF誘導(dǎo)HT29上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（表5，圖 5、6）。

表5 各組細(xì)胞中Vimentin、E-cadherin的mRNA表達(dá)水平Tab 5 The expression levels of mRNA of Vimentin and E-cadherin in each group

圖A、B示各組細(xì)胞Vimentin、E-cadherin mRNA表達(dá)量；*P＜0.01圖5 各組細(xì)胞中Vimentin、E-cadherin的mRNA表達(dá)水平Fig 5 The expression levels of mRNA of Vimentin and E-cadherin in each group

圖6 各組細(xì)胞中Vimentin、E-cadherin的蛋白表達(dá)水平Fig 6 The expression levels of Vimentin and E-cadherin protein in each group

3 討論

近年來腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用被越來越多的人認(rèn)識，其眾多的細(xì)胞成分如內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等也被逐漸認(rèn)知[1]。盡管目前針對腫瘤微環(huán)境的免疫治療已經(jīng)取得了相當(dāng)?shù)某尚В茄装Y細(xì)胞如淋巴細(xì)胞，單核-巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的可塑性和異質(zhì)性嚴(yán)重阻礙了免疫治療的效果。在這種情況下，腫瘤微環(huán)境中另一種重要的細(xì)胞CAFs，可能成為改變腫瘤微環(huán)境并治療腫瘤的新靶點。有些研究認(rèn)為CAFs通過提供結(jié)構(gòu)支架和通過分泌大量的生長因子從而起到促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，有助于腫瘤組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和組織重塑[2-4]。

臨床上部分結(jié)腸癌患者就診時已處于中晚期，己經(jīng)失去手術(shù)治療機(jī)會。而且有些患者手術(shù)后很快發(fā)生復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。惡性腫瘤最主要的特征之一是轉(zhuǎn)移，腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的多級的生物學(xué)過程，而腫瘤細(xì)胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵一步便是EMT[8]。EMT的主要特征是上皮細(xì)胞表型標(biāo)記物的表達(dá)下調(diào)或缺失（如E-cadherin），而間質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)記物（如 Vimentin、N-cadherin等）表達(dá)上調(diào)[9-10]。TGF-β能介導(dǎo)EMT發(fā)生的現(xiàn)象首先在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)[11]。TGF-β分子主要通過β-整合素信號傳導(dǎo)途徑促進(jìn)Smad（主要是Smad3）分子依賴的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄過程的發(fā)生，也可通過非Smad分子依賴信號傳導(dǎo)途徑和調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用引起EMT[12]。吡非尼酮是一個有效的抗纖維化藥物，但作用機(jī)制尚不清楚。目前研究顯示吡非尼酮可以減弱成纖維細(xì)胞受到細(xì)胞生長因子如TGF-β刺激后的細(xì)胞增殖、纖維化相關(guān)蛋白和細(xì)胞因子產(chǎn)生[5-6]。目前，吡非尼酮對結(jié)腸癌相關(guān)CAFs的作用還需要進(jìn)一步研究。

吡非尼酮作為一種細(xì)胞因子抑制劑可以改變成纖維細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子及生長因子[7]。本實驗中，利用CAFs誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29后發(fā)現(xiàn)，HT29增殖能力增加，間質(zhì)表型標(biāo)志物Vimentin表達(dá)水平顯著升高，上皮表型標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。這表明CAFs可能通過分泌細(xì)胞因子促進(jìn)HT29細(xì)胞EMT的發(fā)生。條件培養(yǎng)基培養(yǎng)HT29細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，吡非尼酮處理后CAFs條件培養(yǎng)基促進(jìn)HT29細(xì)胞增殖能力明顯減弱。ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清，結(jié)果顯示，使用吡非尼酮干預(yù)CAFs后TGF-β1分泌量顯著降低，但是IL-6的分泌量在各組之間并未發(fā)生明顯的變化。同時，Western blot及PCR結(jié)果顯示，吡非尼酮處理后CAFs條件培養(yǎng)基與HT29細(xì)胞共培養(yǎng)以后，相對于對照組，間質(zhì)表型Vimentin表達(dá)水平明顯受抑制。Transwell實驗表明，吡非尼酮干預(yù)CAFs后，與未干預(yù)組相比腫瘤細(xì)胞的侵襲性和遷移性明顯減弱。吡非尼酮通過抑制結(jié)腸癌相關(guān)CAFs分泌TGF-β1，抑制HT29細(xì)胞發(fā)生EMT可能是吡非尼酮的作用機(jī)制之一。

綜上所述，隨著對腫瘤微環(huán)境研究的深入，吡非尼酮抑制腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）可能作為結(jié)腸癌治療及預(yù)后新思路。