免疫親和柱凈化-高效液相色譜法檢測兩種飲料中雙酚A含量

王 勇,黃紫樂,李 蓉,吳 冰,鄭傳發(fā),陳定虎,邱德義

(中山出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,廣東中山 528403)

雙酚A(Bisphenol A,BPA),學名為2,2-二(4-羥基苯基)丙烷,主要用于生產(chǎn)多種高分子材料。在塑料制品的制造過程中,添加雙酚A可以使其具有無色透明、耐用、輕巧和突出的防沖擊性等特性,因此也廣泛用于飲料的包裝、奶瓶、水瓶等日用品的制造過程中[1]。每年,全世界將近生產(chǎn)2700萬噸含有雙酚A的塑料[2]。然而其安全性問題成為了公眾關注的焦點,研究發(fā)現(xiàn)雙酚A屬于一種環(huán)境激素,能夠產(chǎn)生環(huán)境污染問題[3-5]。它具有模擬生物體內(nèi)激素的作用,影響并干擾生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能,導致人和動物的生殖系統(tǒng)發(fā)育不良,生育能力下降,并引起各種生理異常[6-7]。長期大量接觸雙酚A,會對腎臟、肝臟、脾臟、胰腺和肺等多個器官系統(tǒng)產(chǎn)生損害,而且它對人體的影響是累積的、不可逆的,是一種持續(xù)性的危害[8-11]。

2011年我國明確規(guī)定禁止生產(chǎn)、進口及銷售含雙酚A的嬰幼兒奶瓶[12]。但是到目前為止,我國還沒有食品中雙酚A衛(wèi)生標準和檢測方法標準。我國 GB 13116-1991《食品容器及包裝材料用聚碳酸酯樹脂衛(wèi)生標準》和GB 14942-1994《食品容器包裝材料用聚碳酸酯成型品衛(wèi)生標準》規(guī)定食品容器及包裝材料中雙酚A(蒸餾水)的溶出量小于等于0.05 mg/L[13-14],上述兩部國家標準對于食品中雙酚A限量具有一定的參考價值。

目前,關于雙酚A含量檢測的研究主要集中在環(huán)境類、食品包裝材料和食品容器等方面[7-9];食品中雙酚A檢測相比較環(huán)境類雙酚A的研究而言較少[15-16],而且沒有國家標準和AOAC檢測方法;而復雜基質(zhì)飲料中雙酚A含量檢測的研究則更少[17]。豆奶是大豆經(jīng)研磨后,萃取性狀良好的呈乳白色至淡黃色的乳狀液體制品。豆奶含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)及多種人體所需的微量元素。橙汁富含維生素、礦質(zhì)元素、膳食纖維等營養(yǎng)成分,有較高的保健價值;且橙汁具有誘人的色澤和香氣,有較好的市場前景。然而到目前為止,沒有關于豆奶和橙汁中雙酚A測定方法的研究,目前比較多的研究采用固相萃取法提取食品中的雙酚A,但是其步驟比較復雜,而且特異性不高。本研究首次采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜法聯(lián)用技術檢測豆奶和橙汁飲料中雙酚A含量,對檢測飲料類復雜基質(zhì)食品中雙酚A含量具有參考作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙酚A免疫親和柱 柱容量500 ng/支 美國VICAM公司;1.5 μm玻璃纖維濾紙 美國3M公司;0.22 μm有機相濾膜 上海安譜公司;乙腈 色譜純，德國Merck公司;甲醇 色譜純，德國Merck公司;氯化鈉 分析純，廣州化學試劑廠;磷酸氫二鈉 分析純，廣州化學試劑廠;磷酸二氫鉀 分析純，廣州化學試劑廠;氯化鉀 分析純，廣州化學試劑廠;實驗用水 為美國Millipore-Q制備的超純水;雙酚A標準品 美國Supelco公司，純度>99%;豆奶和橙汁飲料 市場上購買,分別選購不同廠家生產(chǎn)的塑料瓶裝和玻璃瓶裝飲料各5種。

WATERS Acquity UPLC超高效液相色譜儀-熒光檢測器 美國WATERS公司;離心機 德國Eppendorf;免疫親和柱分離6位泵流操作架 中檢維康公司;高速均質(zhì)器 18000～22000 r/min 美國Warning公司;渦旋振蕩器 德國IKA公司;電子天平 感量:0.0001 g，德國SARTORIUS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的提取 準確量取混勻的豆奶或橙汁飲料樣品15 mL,置于50 mL 離心管中,準確加入15.0 mL甲醇,混勻,振蕩提取30 min,離心5 min(4000 r/min)。準確量取上清液10 mL于50 mL容量瓶中,用 pH7.4 磷酸緩沖溶液定容至50 mL,備用。

1.2.2 樣品凈化 免疫親和柱活化處理:提前取出保存于4 ℃的免疫親和柱,放置于室溫下,恢復室溫。將免疫親和柱連接于10.0 mL玻璃注射器下。將空氣壓力泵與玻璃注射器連接,調(diào)節(jié)壓力使溶液以約2 mL/min流速緩慢通過免疫親和柱,直至2～3 mL空氣通過柱體。準確量取4 mL免疫親和柱活化液活化親和柱,流速為1～2 mL/min,直至2～3 mL空氣通過柱體。以2～3 mL/min流速用5.0 mL純水淋洗柱體1次,棄去全部流出液,并使2～3 mL空氣通過柱體。以2～3 mL/min流速用10.0 mL pH7.4 PBS溶液淋洗柱體,待最后2～3 mL溶液充滿柱體時,停止加壓,用塞子堵住底部出液口,待用。活化后的免疫親和柱在1 h內(nèi)使用。

將活化后的免疫親和柱連接于10.0 mL玻璃注射器下。準確移取20.0 mL樣品提取液注入玻璃注射器中,將空氣壓力泵與玻璃注射器連接,調(diào)節(jié)壓力使溶液以約2 mL/min流速緩慢通過免疫親和柱,直至2～3 mL空氣通過柱體。以2～3 mL/min流速用10.0 mL水淋洗柱體1次,棄去全部流出液,并使2～3 mL空氣通過柱體。準確加入1.0 mL 80%甲醇洗脫,流速為1～2 mL/min,收集全部洗脫液于樣品瓶中,待上液相色譜儀分析。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:Thermo C18柱(50 mm×2.1 mm,1.9 μm);柱溫:30 ℃;樣品室溫度:30 ℃;進樣體積:10 μL;流速:400 μL/min。流動相:甲醇-水(60∶40,v/v),熒光檢測λex=228 nm,λem=310 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用SAS分析軟件對實驗獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果進行差異顯著性分析(新復極差法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的選擇

檢測液體樣品雙酚A的前處理的方法比較多,主要有液液萃取法、固相萃取法、多功能凈化柱分離法等。考慮到豆奶和橙汁飲料樣品基質(zhì)較為復雜,為了盡量減少樣品提取溶液中大量雜質(zhì)的干擾,本研究選取特異性較高的免疫親和柱分離法。免疫親和柱分離法是利用生物體內(nèi)存在的抗原、抗體之間高度特異性的親和力進行分離的方法。因其特異性較高,一般而言,凈化處理的效果較好。本研究按照免疫親和柱生產(chǎn)廠家美國VICAM公司推薦的親和柱活化和樣品凈化程序操作(見1.2.2 樣品凈化),結(jié)果表明,免疫親和柱分離法能夠有效排除豆奶和橙汁飲料中復雜基質(zhì)的干擾。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本實驗選擇Thermo C18柱(50 mm×2.1 mm,1.9 μm)用于色譜峰分離,獲得了良好的分離效果。本實驗對流動相進行了選擇,最初用乙腈和水為液相色譜分析的流動相,結(jié)果對雙酚A的分離效果不大理想,最終選擇甲醇和水作為流動相,并且通過優(yōu)化甲醇和水的比例,最終確定甲醇-水(60∶40,v/v)為流動相,可很好實現(xiàn)雙酚A標準物質(zhì)分離,雙酚A峰形尖銳,峰對稱性好。雙酚A標準品溶液的色譜圖如圖1所示。

圖1 雙酚A標準溶液的高效液相色譜熒光檢測譜圖(5 ng/mL)Fig.1 Chromatograms of standard solution for BPA(5 ng/mL)

2.3 方法學驗證

2.3.1 標準曲線、檢出限和定量限 準確量取適量用二甲基甲酰胺(DMF)配制的濃度為1.0 mg/mL的標準儲備液,用乙腈-水(10∶90,v/v)稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、25.0、100.0、300.0 ng/mL的標準工作液,在上述色譜條件下進行分析測定。以雙酚A的峰面積對標準品的相應濃度進行回歸分析。結(jié)果顯示雙酚A的質(zhì)量濃度為1.0～300.0 ng/mL時,線性關系良好,線性回歸方程為:y=0.0256x-0.0324,相關系數(shù)(R2)為0.9998(如圖2所示)。在1 ng/mL添加水平時,化合物峰的信噪比均大于3,故將其定為檢出限。在3 ng/mL添加水平時,化合物峰的信噪比均大于10,且回收率、相對標準偏差(RSD)等各項指標均滿足食品理化檢測殘留分析的要求,故將其定為定量限。

圖2 雙酚A的標準曲線圖Fig.2 The standard curve of BPA

2.3.2 方法的精密度和回收率 取15.0 mL豆奶和橙汁飲料樣品,分別添加1.0、4.0、16.0 ng/mL 3個添加水平進行回收率和精密度實驗,每個添加水平做6個平行樣品,平均回收率為82.5%～104.6%之間,RSD值為2.3%～6.4%,方法的重現(xiàn)性較好(表1)。

表1 樣品加標回收率和相對標準偏差Table 1 Recovery rate and relative standard deviation for BPA in samples and CV

2.4 實際樣品分析

分別選取玻璃瓶裝和塑料瓶裝的不同款式的豆奶和橙汁飲料,按照本研究方法進行雙酚A含量檢測,結(jié)果表明玻璃瓶裝的豆奶和橙汁飲料中雙酚A含量均小于檢出限1 ng/mL,而某款塑料瓶裝的豆奶和橙汁飲料檢測出極其微量的雙酚A,豆奶和橙汁飲料中雙酚A含量分別為1.44、1.57 ng/mL(表2、圖3、圖4)。根據(jù)我國的GB 13116-1991《食品容器及包裝材料用聚碳酸酯樹脂衛(wèi)生標準》、GB 14942-1994《食品容器包裝材料用聚碳酸酯成型品衛(wèi)生標準》規(guī)定食品容器及包裝材料中雙酚A(蒸餾水,回流6 h)的溶出量小于等于0.05 mg/L[13-14],可以判定本研究中塑料瓶裝豆奶和橙汁中雙酚A含量極其微量,處于可接受水平(小于0.05 mg/L),可認為是塑料瓶中含有較低的雙酚A的本底。

表2 不同包裝豆奶和橙汁中雙酚A含量(ng/mL)Table 2 BPA content in different packed samples of soymilk and orange juice(ng/mL)

圖3 某款塑料瓶裝豆奶樣品中雙酚A的高效液相色譜熒光檢測譜圖Fig.3 Chromatograms of BPA in one kind of soymilk packed in plastic bottles

圖4 某款塑料瓶裝橙汁樣品中雙酚A的高效液相色譜熒光檢測譜圖Fig.4 Chromatograms of BPA in one kind of orange juice packed in plastic bottles

3 結(jié)論

本研究建立了檢測豆奶和橙汁飲料中雙酚A含量的免疫親和柱凈化-高效液相色譜法檢測方法,樣品經(jīng)甲醇提取、離心、pH7.4磷酸緩沖溶液稀釋后,用雙酚A免疫親和柱凈化,用高效液相色譜儀測定。實驗結(jié)果表明,在1.0～300.0 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，雙酚A的濃度與峰面積的線性回歸方程為y=0.0256x-0.0324,R2為0.9998，檢出限為1 ng/mL，平均回收率為82.5%～104.6%，相對標準差為2.3%～6.4%,該方法能夠?qū)崿F(xiàn)雙酚A與樣品基質(zhì)的良好分離。方法學評價結(jié)果表明,該方法的靈敏度、準確度、重復性均較好,抗基質(zhì)干擾能力強,適合豆奶和橙汁飲料中雙酚A含量的檢測,同時為其它種類的飲料中雙酚A含量的檢測提供參考。

本實驗分別選取玻璃瓶裝和塑料瓶裝的不同款式的豆奶和橙汁飲料,按照本研究方法進行雙酚A含量檢測,其中某款塑料瓶裝的豆奶和橙汁飲料檢測出極其微量的雙酚A,其雙酚A含量分別為1.44、1.57 ng/mL,可能與飲料不同、包裝材料本底中含有雙酚A的含量不同有關。