線粒體凋亡途徑在槲皮素誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡中的作用研究①

朱玲玲 趙捷平 竇勤玲 張景利

(牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院血液科，牡丹江157011)

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia)是由造血干細(xì)胞惡變引起的惡性異質(zhì)性疾病，其特征表現(xiàn)為造血系統(tǒng)中幼稚的腫瘤細(xì)胞通過增殖浸潤(rùn)進(jìn)入血液、骨髓等組織，進(jìn)而影響正常造血功能，為血液系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[1，2]。在過去十年中，我國(guó)急性髓系白血病死亡率男女分別居于第6 位和第8 位，處于世界中等水平，且有上升趨勢(shì)，尚沒有明確的預(yù)防和治療措施，為衛(wèi)生機(jī)構(gòu)面臨的巨大挑戰(zhàn)之一[3]。隨著對(duì)急性髓系白血病研究的深入，天然藥物在預(yù)防和治療急性髓系白血病中的作用日益受到重視[4]。槲皮素(Quercetin)又名櫟精、槲皮黃素，屬于黃酮類化合物，廣泛存在于植物的花、葉和果實(shí)(如蘋果、葡萄、洋蔥、茶葉等)中，還存在于一些中藥(如蘆丁、三七、羅布麻、槐米等)中，具有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗腫瘤和抗氧化等藥理作用，尤其是近年來對(duì)其抗腫瘤作用的研究取得很大進(jìn)展[5-7]。研究表明，槲皮素可誘導(dǎo)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞、小鼠膀胱癌MB49細(xì)胞等凋亡[8-10]。然而有關(guān)于槲皮素是否誘導(dǎo)人急性髓系白血病U937細(xì)胞凋亡及可能機(jī)制的研究少見報(bào)道，故本研究采用體外培養(yǎng)U937細(xì)胞，觀察槲皮素對(duì)U937細(xì)胞凋亡的影響以及可能機(jī)制是否與線粒體凋亡途徑有關(guān)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人急性髓系白血病U937細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。

1.1.2主要試劑 槲皮素(純度>98%)、二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)分別為Q4951-10G、D5879-100ML)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司，貨號(hào)31800022、16000-044)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell counting kit-8，CCK-8)(天津百熒生物科技有限公司，批號(hào)35000)；AnnexinV-FITC/PI試劑盒(美國(guó)BD公司，貨號(hào)BD-556547)；碘化丙啶(Propidiumiodide)(美國(guó)Axygen公司，貨號(hào)xy-P4170)；3，3′-二己基含氧碳菁碘代物[3，3′-dihexyloxacarbocyanine iodide，DiOC6(3)](美國(guó)ENZO公司，貨號(hào)ALX-610-046-M050)；兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤因子-2(Human B cell lymphoma factor-2，Bcl-2)多克隆抗體、兔抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白(Human Bcl-2-related X protein，Bax)多克隆抗體、兔抗人細(xì)胞色素c(Cytochrome c，Cyt c)多克隆抗體(美國(guó)Cell Signal公司提供，貨號(hào)分別為2772S、2876S、11932S)；辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔IgGⅡ抗(美國(guó)Abbkine公司，貨號(hào)A-08023)；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(美國(guó)National Diagnostics公司，貨號(hào)SGCL-300)；半胱氨酸蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶-9(Cysteinyl aspartate specific proteinase-8，Caspase-9)活性測(cè)定試劑盒(德國(guó)Roche公司，貨號(hào)分別為12012952001、112769 05001)。

1.1.3主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(HERAcell 240i，美國(guó)Thermofisher Scientific公司)；低溫高速離心機(jī)(GS-15R，美國(guó)BECKMAN公司)；酶標(biāo)儀(RT-6100，美國(guó)Rayto公司)；BD流式細(xì)胞儀(FACScan，美國(guó)BD公司)；電泳儀(PowerPac HV，美國(guó)Bio-Rad公司)；轉(zhuǎn)膜儀(VE-186，上海天能科技有限公司)；蛋白成像系統(tǒng)(ChemiDoc XRS，美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.1.4細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇U937細(xì)胞，懸浮生長(zhǎng)于含有10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(含青霉素100 U/ml和鏈霉素100 μg/ml)，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.5槲皮素配制 槲皮素溶解于DMSO(濃度<0.5%)配成160 μmol/L儲(chǔ)備液，-20℃冰箱保存，臨用時(shí)以RPMI1640培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。

1.2方法

1.2.1CCK-8檢測(cè)U937細(xì)胞增殖 檢測(cè)過程參照CCK-8檢測(cè)試劑盒操作說明書進(jìn)行。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U937細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/ml，接種于96孔板，每孔100 μl。參照文獻(xiàn)[11]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每孔分別加入濃度梯度為0(對(duì)照組，加入RPMI1640培養(yǎng)液100 μl)、10、20、40、80、160 μmol/L槲皮素100 μl。37℃、5%CO2及飽和濕度下分別培養(yǎng)24、48和72 h 后，每孔分別加入CCK-8 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。RT-6100酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(OD)，計(jì)算增殖抑制率(Inhibitory rate)。Inhibitory ratio(%)=(1-OD給藥組/OD空白對(duì)照組)×100%。每個(gè)劑量組設(shè)6個(gè)平行孔，取6孔平均值。

1.2.2流式細(xì)胞儀AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)U937細(xì)胞凋亡 參照CCK-8檢測(cè)結(jié)果，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U937細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/ml，接種于96孔板，每孔100 μl。隨機(jī)分為：空白對(duì)照組(Control)：每孔加入RPMI1640培養(yǎng)液100 μl；槲皮素10 μmol/L組：每孔加入10 μmol/L 槲皮素100 μl；槲皮素20 μmol/L組：每孔加入20 μmol/L 槲皮素100 μl；槲皮素40 μmol/L組：每孔加入40 μmol/L槲皮素100 μl。各組U937細(xì)胞37℃、5%CO2及飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。1 200 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，1 ml PBS沖洗2次，500 μl Binding Buffer重懸成單細(xì)胞懸液，依次加入Annexin V-FITC和Propidiumiodide液各5 μl混勻，室溫避光反應(yīng)15 min。1 h內(nèi)以FACScan流式細(xì)胞儀檢測(cè)U937細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算總細(xì)胞凋亡率(Apoptosis rate)。Apoptosis rate(%)=右下象限的早期凋亡(Early apoptosis)細(xì)胞百分率+右上象限的晚期凋亡(Late apoptosis)細(xì)胞百分率。每個(gè)劑量組設(shè)6個(gè)平行孔，取6孔平均值。

1.2.3線粒體膜電位(Δψm)檢測(cè) 分組及給藥同1.2.2。1 200 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，加入40 μmol/L DiOC6(3) 0.1 ml，37℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)15 min，1 ml PBS沖洗2次。1 ml PBS重懸成單細(xì)胞懸液，F(xiàn)ACScan流式細(xì)胞儀測(cè)定DiOC6(3)在細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。以DiOC6(3)熒光強(qiáng)度間接反映出Δψm的高低。DiOC6(3)的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。每個(gè)劑量組設(shè)6個(gè)平行孔，取6孔平均值。

1.2.4Western blot分析檢測(cè)Bcl-2、Bax、Cyt c的表達(dá) 分組及給藥同1.2.2。加入含有25 mmol/ml HEPES、1% Tris-HCl、50 mmol/ml NaCl、1 mmol/ml EDTA、1 mmol/ml EGTA、1 mmol/ml PMSF和1 μg/ml 亮肽素的冰冷的裂解緩沖液(pH=7.4)，10 000 r/min 4℃離心10 min，棄沉渣，收集上清液，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取50 μg蛋白上樣后進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)80 min后將蛋白轉(zhuǎn)至0.45 μm PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。分別與兔抗人Bcl-2多克隆抗體(1∶500稀釋)，兔抗人Bax多克隆抗體(1∶500稀釋)，兔抗人Cyt c多克隆抗體(1∶500稀釋)4℃孵育過夜，1×TBS-T洗膜后加辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔Ⅱ抗孵育2 h。以GAPDH(1∶500稀釋)單克隆抗體重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)過程，作為內(nèi)參對(duì)照。ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色。ChemiDoc XRS蛋白成像系統(tǒng)對(duì)各組條帶進(jìn)行計(jì)值及統(tǒng)計(jì)分析。每份樣品檢測(cè)6次，取平均值。

1.2.5Caspase-3、Caspase-9活性檢測(cè) 分組及給藥同1.2.2。嚴(yán)格按照Caspase-3、Caspase-9活性測(cè)定試劑盒說明進(jìn)行檢測(cè)，以RT-6100酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)405 nm處的吸光度值(OD)表示活性變化。每份樣品檢測(cè)6次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1槲皮素對(duì)U937細(xì)胞增殖的影響 CCK-8結(jié)果顯示(圖1)，U937細(xì)胞經(jīng)濃度梯度0、10、20、40、80、160 μmol/L 槲皮素處理24、48和72 h后，槲皮素對(duì)U937細(xì)胞的增殖抑制率隨著劑量的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸加強(qiáng)，既槲皮素呈時(shí)間-劑量依賴性地抑制U937細(xì)胞的增殖。槲皮素作用24、48和72 h的IC50分別為(143.9±12.6)，(51.4±4.2)和(30.1±2.7)μmol/L，故此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用≤40 μmol/L(即10、20、40 μmol/L)槲皮素及48 h作為實(shí)驗(yàn)濃度和處理時(shí)間。

2.2槲皮素對(duì)U937細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示(圖2)，槲皮素10、20、40 μmol/L組U937細(xì)胞凋亡率顯著升高，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3槲皮素對(duì)U937細(xì)胞Δψm的影響 經(jīng)DiOC6(3)染色，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DiOC6(3)熒光強(qiáng)度(M1部分)(圖3)，DiOC6(3)染色陰性的細(xì)胞表現(xiàn)為弱的熒光強(qiáng)度(Hypofluorescence)，被認(rèn)為是Δψm丟失的細(xì)胞，表示Δψm降低。結(jié)果顯示，槲皮素10、20和40 μmol/L組弱熒光強(qiáng)度細(xì)胞百分率顯著升高，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明槲皮素可使Δψm丟失的細(xì)胞增多，從而降低Δψm。

圖1 不同劑量槲皮素對(duì)U937細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of quercetin on proliferations of U937 cells

圖2 槲皮素對(duì)U937細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of quercetin on apoptosis of U937 cellsNote:Compared with control，*.P<0.01.

圖3 槲皮素對(duì)U937細(xì)胞Δψm的影響Fig.3 Effects of quercetin on Δψm of U937 cellsNote:Compared with control，*.P<0.01.

圖4 槲皮素對(duì)U937細(xì)胞Bcl-2、Bax和Cyt c表達(dá)的影響Fig.4 Effects of quercetin on expressions of Bcl-2，Bax and Cyt c of U937 cellsNote:Compared with control，*.P<0.01.

圖5 槲皮素對(duì)U937細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性的影響Fig.5 Effects of quercetin on activities of Caspase-3 and Caspase-9 of U937 cellsNote:Compared with control，*.P<0.01.

2.4槲皮素對(duì)U937細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、Cyt c表達(dá)的影響 Western blot分析結(jié)果顯示(圖4)，槲皮素10、20、40 μmol/L組U937細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2/Bax比值顯著下調(diào)，Cyt c表達(dá)顯著上調(diào)，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.5槲皮素對(duì)U937細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性的影響 比色分析結(jié)果顯示(圖5)，槲皮素10、20、40 μmol/L組U937細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性明顯增高，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素對(duì)U937細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，且呈時(shí)間-劑量依賴性。以上結(jié)果提示，槲皮素可能對(duì)U937細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用。

同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)，槲皮素亦能誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡，凋亡率顯著升高。細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡，是指機(jī)體為了維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)通路和基因調(diào)控的一種生理性死亡過程，對(duì)機(jī)體組織和器官的發(fā)育及防御致病因素具有十分重要作用。細(xì)胞凋亡途徑根據(jù)啟動(dòng)過程主要包括線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑三種途徑，而線粒體途徑在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中承擔(dān)著重要角色[12，13]。線粒體是凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞器，在凋亡過程中具有重要的調(diào)控作用[14]。凋亡信號(hào)可通過激活多條上游通路而作用于線粒體。線粒體將凋亡信息整合后，發(fā)生形態(tài)或功能的改變，導(dǎo)致線粒體膜間隙的促凋亡因子(如Cyt c)釋放。Δψm是反映線粒體內(nèi)膜通透性的最佳指標(biāo)之一，細(xì)胞是否正常與線粒體Δψm 有著密切關(guān)系，若Δψm下降則認(rèn)為細(xì)胞必定凋亡至死[15，16]。Δψm的破壞被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件之一[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可明顯降低Δψm，提示槲皮素誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡機(jī)制之一可能是通過線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。為了進(jìn)一步探討槲皮素誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡與線粒體凋亡途徑的關(guān)系，本研究對(duì)Bcl-2、Bax、Cyt c表達(dá)及Caspase-3、Caspase-9活性進(jìn)行了檢測(cè)。

Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡的線粒體凋亡途徑中起著非常重要的作用，其中Bcl-2和Bax分屬Bcl-2家族中的抗凋亡和促凋亡兩部分，通過維持抗凋亡、促凋亡成員的平衡來維持線粒體膜的完整性[18]。細(xì)胞凋亡是否發(fā)生由Bcl-2與Bax比值決定，Bcl-2/Bax比值是反映細(xì)胞生存能力的重要指標(biāo)，即Bcl-2表達(dá)水平增加，Bcl-2/Bax異二聚體比例增加，抑制細(xì)胞凋亡；Bax蛋白水平增加時(shí)，Bcl-2/Bax比值下降，產(chǎn)生Bax/Bax同二聚體，細(xì)胞凋亡發(fā)生[19,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素顯著下調(diào)U937細(xì)胞Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，下調(diào)Bcl-2/Bax比值。Cyt c是一種水溶性小分子物質(zhì)，位于線粒體中，是線粒體呼吸鏈中傳遞電子的載體，而且是細(xì)胞凋亡調(diào)控的主要蛋白，也是最早被發(fā)現(xiàn)的線粒體釋放的促凋亡蛋白[21,22]。半胱氨酸蛋白酶(Caspases)是一個(gè)在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用的酶家族，是細(xì)胞凋亡的介導(dǎo)者和執(zhí)行者，激活或超量表達(dá)均會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生凋亡，又稱凋亡蛋白酶，對(duì)凋亡起關(guān)鍵作用[23]。細(xì)胞的凋亡是由Caspase逐步發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起的，而Caspase-9激活是線粒體通路激活的重要環(huán)節(jié)[24]。當(dāng)Δψm降低后，線粒體膜腫脹、發(fā)生形態(tài)或功能的改變、通透性增高、導(dǎo)致Cyt c從內(nèi)膜脫落出來并釋放到胞漿中，能夠使細(xì)胞Caspase-9前體自身催化形成有活性的Caspase-9，隨后激活下游Caspase-3等效應(yīng)Caspases分子，從而發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25,26]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，槲皮素顯著上調(diào)U937細(xì)胞Cyt c表達(dá)，并升高Caspase-3和Caspase-9活性。綜合以上結(jié)果提示，槲皮素誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與線粒體凋亡途徑激活有關(guān)。

綜上所述，槲皮素可顯著抑制U937細(xì)胞增殖，線粒體凋亡途徑激活是槲皮素誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡的途徑之一。本研究局限之處在于尚未觀察槲皮素對(duì)U937細(xì)胞Cyt c分布以及Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的影響。有關(guān)于槲皮素對(duì)U937細(xì)胞Cyt c分布以及Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的影響，本研究人員將會(huì)作進(jìn)一步探討。