沉默HIF-1α表達逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)肝癌免疫抑制的實驗研究

李 偉 劉 娜 孫巨勇 姚新潔 李慶祿 李新國

(哈勵遜國際和平醫(yī)院檢驗科，衡水053000)

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、死亡率分別位居惡性腫瘤第四位與第二位[1]。大多數(shù)惡性腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中，通常伴隨著部分內(nèi)部腫瘤組織存在缺氧現(xiàn)象[2]。研究表明，缺氧是實體腫瘤的特征之一，缺氧有助于腫瘤內(nèi)的免疫抑制，幫助癌細胞逃避免疫攻擊及抑制免疫殺傷功能[3]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是癌細胞在缺氧條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子，與腫瘤生長、血管形成、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4,5]。陸曄斌等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌中HIF-1α可能負調(diào)控MICA/B的表達，進而參與低氧對胰腺癌免疫抑制的調(diào)控。肝癌組織中HIF-1α表達異常增高，且與患者的無瘤生存時間密切相關(guān)[7]。然而，在肝癌中HIF-1α是否參與缺氧誘導(dǎo)的免疫抑制仍不完全清楚。本研究將通過缺氧誘導(dǎo)小鼠荷瘤模型，研究缺氧組織中HIF-1α及相關(guān)腫瘤免疫因子表達，構(gòu)建沉默HIF-1α小鼠Hepa1-6細胞移植瘤模型，觀察敲減HIF-1α后腫瘤浸潤免疫細胞及免疫因子表達變化，以期揭示缺氧誘導(dǎo)肝癌免疫逃逸的分子機制，為臨床尋找診治惡性腫瘤方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠肝癌細胞Hepa1-6購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，健康SPF級C57BL/6小鼠，體重18～22 g，購自上海實驗動物中心；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品；HIF-1α、GAPDH抗體購自CST公司；FITC-CD4小鼠抗體、APC-CD25小鼠抗體和PE-Foxp3小鼠抗體購自eBioscience公司；TRIzol、Script Ⅱ reverse transcriptase逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBR green master mix試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 小鼠肝癌細胞Hepa1-6采用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃、體積分數(shù)為5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細胞穩(wěn)定株篩選 將化學(xué)合成的shHIF-1α核苷酸序列克隆至pLKO.1-puro質(zhì)粒中，構(gòu)建敲減HIF-1α慢病毒載體pLKO.1-shHIF1α，并包裝慢病毒。取適量對數(shù)生長期的Hepa1-6細胞接種于6孔板中，待培養(yǎng)過夜達30%時，加入慢病毒感染細胞，20 h后換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，培養(yǎng)液中加入1 μg/ml的嘌呤霉素溶液進行篩選，每隔2 d更換新鮮培養(yǎng)液，約1個月后，對細胞進行鑒定并保種。敲減HIF-1α的核苷酸序列為：5′-CTG ATG ACC AGC AAC TTG A-3′。

1.2.3皮下移植 取6周齡SPF級C57BL/6小鼠20只，將對數(shù)生長期Hepa1-6細胞，消化后用無血清DMEM稀釋成1×107ml-1，注射器吸取200 μl接種于小鼠右腋皮下。將小鼠隨機分為2組，常氧飼養(yǎng)組和缺氧飼養(yǎng)組，常氧飼養(yǎng)條件:21%O2、5%CO2、74%N2;缺氧飼養(yǎng)條件:10%O2、5%CO2、85%N2;缺氧飼養(yǎng)采用12/12 h晝夜循環(huán)方式，缺氧時間具體為:早8:00～晚20:00[8]。

另取20只C57BL/6小鼠，隨機分為2組，每組10只，將Control和shHIF-1α細胞消化稀釋1×107ml-1，注射器吸取200 μl接種于小鼠右腋皮下，分別記為Control組和shHIF-1α組。約6周后，將小鼠安樂死并收集所有的移植瘤用于免疫細胞分析或基因表達分析。

1.2.4免疫組化分析 小鼠處死前1 h腹腔注射60 mg/kg 的缺氧探針HypoxyprobeTM-1，根據(jù)試劑盒說明書，經(jīng)免疫組化染色分析其表達和分布區(qū)域。另采用免疫組化法檢測小鼠移植瘤組織HIF-1α表達情況，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2.5qPCR檢測 取移植瘤組織采用TRIzol試劑提取各組總RNA，Nanodrop 2000測各組RNA濃度，并按照Script Ⅱ reverse transcriptase逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用2×SYBR green master mix試劑盒qPCR檢測各組細胞腫瘤抑制因子IFN-γ、IL-12b和CXCL10以及腫瘤促進因子IL-10、IL-1β和IL-17相對表達量[9-12]。引物如下：IFN-γ：F-5′-TTT GAG GTC AAC AAC CCA CAG GTC-3′、R-5′-TTT CCG CTT CCT GAG GCT GGA TT-3′；IL-12b：F-5′-GGA AGC ACG GCA GCA GAA TA-3′、R-5′-AAC TTG AGG GAG AAG TAG GAA TGG-3′；CXCL10:F-5′-TGC AAG TCT ATC CTG TCC GCA TGT-3′、R-5′-CCT TCT TTG GCT CAC CGC TTT CAA-3′；IL-10：F-5′-CTG TCA TCG ATT TCT CCC TGT GAG-3′、R-5′-TGA GTG TCA CGT AGG CTT TCA TGC-3′；IL-1β：F-5′-CAA CCA ACA AGT GAT ATT CTC CAT G-3′、R-5′-GAT CCA CAC TCT CCA GCT GCA-3′；IL-17：F-5′-TCT GAG CCA GCC AAG AAG AAG TGT-3′、R-5′-TTC CAA CCC AAA CAT AGG CAC-3′；β-actin：F-5′-AGC TGT GCT ATG TTG CCC TAG ACT-3′、R-5′-ACC GCT CAT TGC CGA TAG TGA TGA-3′。

1.2.6Western blot檢測 用RIPA裂解液抽提移植瘤組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度。用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂牛奶封閉，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗37℃孵育2 h，最后用電化學(xué)發(fā)光曝光顯影，以GAPDH表達為內(nèi)參。

1.2.7流式細胞儀檢測移植瘤組織CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞含量 獲取移植瘤組織，剪去結(jié)締組織，RPMI1640培養(yǎng)基沖洗干凈，眼科剪將移植瘤剪成1～2 mm3小塊，置于含膠原酶的消化液中，于37℃培養(yǎng)箱消化1 h，后用100目篩網(wǎng)過濾去除未消化好的組織塊，將得到的細胞懸液50 g離心1 min，以去除殘留組織塊。取上清移至新的離心管中，400 g離心10 min，用2 ml RPMI1640重懸細胞。取新離心管依次加入70% percoll和40%percoll各4 ml，沿管壁將細胞懸液緩慢加至分離液上面，2 000 r/min離心20 min，將位于70% percoll和40%percoll界面的淋巴細胞移至新離心管中，RPMI-1640洗滌細胞2次以去除殘留淋巴細胞分離液。

調(diào)整細胞濃度至2×107ml-1，取5只流式管，分別記為空白、CD25同型對照、CD4CD25、Foxp3同型對照、CD4CD25Foxp3，于各管中分別加入100 μl細胞懸液。各管分別加入CD4、CD25抗體及同型對照，空白管不加任何抗體，CD25同型對照管加CD4抗體和CD25同型對照抗體，CD4CD25管加CD4抗體和CD25抗體，F(xiàn)oxp3同型對照管加CD4抗體和CD25抗體，CD4CD25Foxp3加CD4抗體和CD25抗體，混勻，4℃避光孵育30 min，混勻4℃避光孵育30 min，加2 ml染色緩沖液1 500 r/min離心5 min洗滌細胞2次，邊渦旋邊加冷固定/穿膜劑1 ml，4℃避光孵育30 min～18 h，加穿膜緩沖液2 ml，1 200 r/min×5 min離心洗滌2次，棄上清液?？瞻?、CD25同型對照、CD4CD25管用300～400 μl染色緩沖液懸浮，混勻避光待測。Foxp3同型對照、CD4CD25Foxp3管中分別加入穿膜緩沖液稀釋的Foxp3同型對照抗體或抗體，4℃避光孵育30 min，穿膜劑緩沖液2 ml，1 200 r/min離心5 min洗滌細胞2次，用300～400 μl染色緩沖液重懸后于流式細胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1HIF-1α在缺氧肝移植瘤組織中的表達 本研究利用低氧探針標(biāo)記缺氧組織，免疫組化檢測肝移植瘤非缺氧組織和缺氧組織HIF-1α表達，經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，缺氧組織中HIF-1α表達顯著高于非缺氧組(1.09±0.23，3.44±0.45；t=14.704 7，P=0.000 0)，結(jié)果表明，HIF-1α在缺氧肝移植瘤組織中高表達(見圖1)。

2.2缺氧肝移植瘤組織中免疫因子表達 最近研究表明，缺氧/HIF-1α信號能夠抑制宿主抵御癌癥[13,14]。為了證實這一觀點，我們檢測了肝移植瘤缺氧組織炎癥和免疫因子的表達，結(jié)果如表1顯示，與非缺氧組織相比，抗腫瘤因子IFN-γ、IL-12b和CXCL10表達水平顯著降低(tIFN-γ=4.031 9，PIFN-γ=0.000 8；tIL-12b=4.889，PIL-12b=0.000 1；tCXCL10=2.212 9，PCXCL10=0.040 1)，相反，腫瘤促進因子IL-10、IL-1β和IL-17表達顯著增加(tIL-10=2.931 6，PIL-10=0.008 9；tIL-1β=8.723，PIL-1β=0.000 0；tIL-17=3.650 7，PIL-17=0.001 8)。結(jié)果表明，腫瘤缺氧與免疫抑制有關(guān)，見圖2。

2.3構(gòu)建敲減HIF-1α的肝移植瘤 結(jié)果如圖2所示，與Control組相比，敲減HIF-1α后肝癌細胞Hepa1-6小鼠移植瘤瘤重明顯降低(1.47±0.12，0.48±0.03，t=25.309 8，P=0.000 0)，抑制了腫瘤生長。

2.4沉默HIF-1α的移植瘤中腫瘤浸潤免疫細胞表達變化 流式細胞術(shù)檢測沉默HIF-1α的移植瘤中腫瘤浸潤免疫細胞CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞含量較Control組明顯降低(13.80±2.43，2.97±1.15，t=12.739 1，P=0.000)，見圖3。

圖1 HIF-1α在缺氧與非缺氧肝移植瘤組織中的表達Fig.1 Expression of HIF-1α in hypoxic and non-hypoxic liver xenograftsNote: Compared with non-hypoxic group,*.P<0.05.

GroupsThe relative level of immune factorsIFN-γIL-12bCXCL10IL-10IL-1βIL-17Hon-hypoxic tissues group0.006 22±0.003 410.002 23±0.001 320.002 85±0.001 460.001 95±0.001 350.001 14±0.000 240.000 31±0.000 69Hypoxic tissues group0.001 82±0.000 531)0.000 15±0.000 261)0.001 74±0.000621)0.004 28±0.002 121)0.008 37±0.002 611)0.002 05±0.001 341)

Note：1)P<0.05 compared to non-hypoxic tissues group.

GroupsThe relative level of immune factorsIFN-γIL-12bCXCL10IL-10IL-1βIL-17Control group0.007 84±0.001 410.002 13±0.000 920.029 8±0.002 60.001 36±0.000 340.005 36±0.000 720.000 63±0.000 31shHIF-1α group0.013 97±0.001 451)0.004 46±0.001 021)0.052 4±0.013 21)0.004 65±0.002 121)0.009 61±0.003 011)0.001 34±0.000 261)

Note：1)P<0.05 compared to Control group.

圖2 敲減HIF-1α抑制小鼠肝癌細胞移植瘤生長Fig.2 Knockdown of HIF-1α inhibited growth of mouse hepatoma cell xenograftsNote: A.The relative tumor weight;B.The expression of HIF-1α in the transplanted tumor was detected by Western blot;compared with Control group,*.P<0.05.

2.5沉默HIF-1α的移植瘤中免疫因子表達變化 移植瘤中免疫因子表達結(jié)果如表2所示，與Control組相比，敲減HIF-1α后移植瘤組織中抗腫瘤因子IFN-γ、IL-12b和CXCL10表達水平顯著增加(tIFN-γ=9.584 4，PIFN-γ=0.000 0；tIL-12b=5.364 1，PIL-12b=0.000 0；tCXCL10=5.312 1，PCXCL10=0.000 0)，相反，腫瘤促進因子IL-10、IL-1β和IL-17表達顯著降低(tIL-10=4.845 6，PIL-10=0.000 1；tIL-1β=4.342 5，PIL-1β=0.000 4；tIL-17=5.549 2，PIL-17=0.000 0)。由此可知，腫瘤組織中HIF-1α表達與免疫抑制有關(guān)。

3 討論

肝癌是常見惡性腫瘤，其發(fā)病率居全世界惡性腫瘤第5位，死亡率高居第3位[15]，而在我國無論發(fā)病率還是死亡率均居惡性腫瘤第二位，且我國每年因肝癌死亡人數(shù)多達23萬，約占全球肝癌死亡人數(shù)的55%，我國是一個肝癌大國[16,17]。由于肝癌早期無癥狀不明顯，病情進展迅速，多數(shù)患者確診時已處于中晚期失去治療機會，僅有部分患者能夠進行手術(shù)切除等根治性治療，但這部分患者術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高達60%～70%，預(yù)后極差[18,19]。因此，急需對肝癌惡化機制進行深入研究，尋找理想的治療靶標(biāo)。

缺氧是實體腫瘤的特征之一，缺氧微環(huán)境能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞中與増殖、分化、凋亡、能量代謝、血管形成、侵襲轉(zhuǎn)移及放化療耐受等相關(guān)癌基因表達，來維持癌細胞生長和轉(zhuǎn)移等惡性表型[20,21]。HIF-1α是缺氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，能夠影響多種原癌基因、腫瘤免疫因子的表達，如VEGF、IL-8、IL-6及TNF-α等，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。大量研究表明，HIF-1α在乳腺癌、胃癌及肝癌等腫瘤組織中異常高表達，且與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期等預(yù)后指標(biāo)相關(guān)[22-25]，HIF-1α在肝癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。本研究通過構(gòu)建肝移植瘤缺氧模型并利用缺氧探針進行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)相較于非缺氧組織，缺氧組織中HIF-1α顯著高表達，這與先前研究結(jié)論一致[7]。癌細胞逃避免疫應(yīng)答的能力對于腫瘤惡性表型出現(xiàn)是至關(guān)重要的[26]。缺氧有助于腫瘤內(nèi)的免疫抑制，幫助癌細胞逃避免疫攻擊以及抑制免疫殺傷功能[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，與非缺氧組織相比，缺氧組織中腫瘤抑制因子IFN-γ、IL-12b和CXCL10低表達，腫瘤促進因子IL-10、IL-1β和IL-17高表達。上述結(jié)果提示，缺氧誘導(dǎo)HIF-1α高表達可能與腫瘤免疫抑制有關(guān)。

圖3 移植瘤組織中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞含量Fig.3 Content of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells in xenograft tumorsNote: Compared with Control group,*.P<0.05.

研究發(fā)現(xiàn)，免疫抑制細胞在腫瘤的低氧區(qū)積累，能夠激活癌細胞免疫耐受機制使其逃避宿主免疫監(jiān)視促進腫瘤進展，如調(diào)節(jié)性T細胞[13,28]。本研究構(gòu)建了穩(wěn)定敲減HIF-1α的Hepa1-6小鼠肝癌細胞移植瘤模型，敲減HIF-1α后腫瘤生長顯著抑制，并且腫瘤浸潤免疫抑制細胞CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞顯著降低，腫瘤促進因子IL-10、IL-1β和IL-17表達也明顯降低，相反腫瘤抑制因子IFN-γ、IL-12b和CXCL10表達顯著增加。上述結(jié)果表明，沉默HIF1-α表達可逆轉(zhuǎn)肝癌免疫抑制。本研究通過構(gòu)建小鼠動物模型揭示了HIF1-α在肝癌免疫抑制中的作用，進一步揭示了缺氧誘導(dǎo)腫瘤免疫抑制的分子機制，為將來尋找診治惡性腫瘤手段提供了一定實驗基礎(chǔ)。