miR-152-3p靶向TCF4對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用①

肖登峰 陳思陽(yáng) 王 琳 張小林

(湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬惠濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科,孝感432000)

胃癌是世界第四大常見(jiàn)惡性腫瘤，是導(dǎo)致癌癥患者死亡的第二大原因[1]。近幾年來(lái)，胃癌早期診斷技術(shù)和圍術(shù)期治療水平的提高在一定程度上減少了胃癌死亡人數(shù)，但胃癌仍是嚴(yán)重威脅人類生命健康的一大疾病[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年約有700 000胃癌新發(fā)病例，約有500 000人死于胃癌[3]。其中，大多數(shù)患者確診時(shí)都已處于胃癌晚期，并且5年內(nèi)生存率不足20%[4]。因此，尋找胃癌早期的診斷指標(biāo)及治療靶點(diǎn)是降低胃癌死亡率的關(guān)鍵。研究表明，癌癥的發(fā)病機(jī)制多與原癌基因的激活和抑癌基因的抑制有關(guān)[5]。miR-152-3p是一類抑癌基因，在卵巢癌、肝癌、肺癌及鼻咽癌等癌癥中表達(dá)水平明顯降低[6-9]。也有研究表明miR-152-3p與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，miR-152-3p能抑制胃癌患者腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[10]。但miR-152-3p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及凋亡的作用及機(jī)制還有待探討。本文以人胃癌SGC-7901細(xì)胞為研究對(duì)象，探究miR-152-3p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及凋亡的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清和0.25%胰酶 (美國(guó)，Gibco)；RIPA裂解液、Trizol試劑 和熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(美國(guó)，Solarbio)；BCA試劑盒 (中國(guó)，碧云天生物科技公司)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒 (美國(guó)，Invitrogen)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(美國(guó)，ThermoFisher)；TCF4一抗、GAPDH抗體和HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗 (英國(guó)，Abcam)。miR-152類似物 (miR-152 mimic)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，TCF pcDNA重組質(zhì)粒(pcDNA TCF4,pc-TCF4)由上海生工設(shè)計(jì)合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌SGC-7901細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液將SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每?jī)商鞊Q液一次。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，融合率達(dá)到85%以上進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將胃癌SGC-7901細(xì)胞用胰酶消化后，用培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為2×106個(gè)/ml，并接種于12孔培養(yǎng)板中，每孔1 ml細(xì)胞懸液。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)利用Lipofectamine2000將miR-152 mimic和pc-TCF4轉(zhuǎn)染到SGC-7901細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4 h后將轉(zhuǎn)染液更換為正常細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3RT-PCR 將細(xì)胞隨機(jī)分為SGC-7901組、mimic-scramble組和miR-152 mimic組，miR-152 mimic組加入含有miR-152 mimic轉(zhuǎn)染液進(jìn)行轉(zhuǎn)染，mimic-scramble組加入不含miR-152 mimic的轉(zhuǎn)染液進(jìn)行轉(zhuǎn)染，SGC-7901則加入正常細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。48 h后用Trizol試劑提取細(xì)胞RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成miR-152-3p和TCF4的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，根據(jù)熒光定量PCR試劑盒對(duì)cDNA進(jìn)行檢測(cè)，用2-ΔΔCt法對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析，以GAPDH為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)所用引物由上海生工設(shè)計(jì)合成。引物序列如下：miR-152-3p上游引物：5′-ACACTCCAGC-TGGGTCAGTGCATGACAG-3′，下游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGC-CAAGTT-3′;TCF4上游引物：5′-CTTCCTCCAAAC-CAGCAACC-3′，下游引物：5′-CCCAACATTCCTGC-ATAGCC-3′；GAPDH 上游引物：5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，下游引物：5′-AAGTGGTCGTTG-AGGGCAATG-3′。

1.2.4熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 用生物信息預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-152-3p與TCF4的結(jié)合片段，用PCR對(duì)結(jié)合片段進(jìn)行擴(kuò)增。將miR-152-3p與TCF4的基因結(jié)合片段插入到熒光素酶載體中，構(gòu)建TCF4野生質(zhì)粒；利用基因突變技術(shù)將結(jié)合片段中的個(gè)別核苷酸突變，構(gòu)建TCF4突變質(zhì)粒。用miR-152 mimic和TCF4野生質(zhì)?；騎CF突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞，根據(jù)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組熒光素酶活性。

1.2.5Western blot 將細(xì)胞隨機(jī)分為SGC-7901組、miR-152 mimic組、pc-TCF4組和mimic+pc-TCF4組，用miR-152 mimic和pc-TCF4轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后，用10%SDS-PAGE分離各組細(xì)胞蛋白并轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到PVDF膜。配制5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白，2 h后加入TCF4一抗 (1∶1 000) 4℃封閉過(guò)夜。第二天洗去未結(jié)合一抗，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h后滴加ECL曝光顯影。以GAPDH為內(nèi)參，用Image J軟件對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行半定量分析。

1.2.6CCK8 將細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml。將細(xì)胞隨機(jī)分為SGC-7901組、miR-152 mimic組，pc-TCF4組和mimic + pc-TCF4組，分別用不含目的基因的載體、miR-152 mimic、pc-TCF4和miR-152 mimic協(xié)同pc-TCF4分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并連續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72和96 h。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)每孔加入10 μl CKK8試劑，重新置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞活性，計(jì)算細(xì)胞增殖倍數(shù)(增殖倍數(shù)=細(xì)胞吸光度/該組0 h細(xì)胞吸光度)。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù) 將細(xì)胞接種于6孔板中，并隨機(jī)分為SGC-7901組、miR-152 mimic組、pc-TCF4組和mimic + pc-TCF4組，用miR-152 mimic和pc-TCF4分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，用胰酶收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，用培養(yǎng)液制成濃度為1×106ml-1的細(xì)胞懸液。根據(jù)FITC-Annexin V試劑盒說(shuō)明書(shū)每個(gè)試管分別加入 5 μl 的FITC-Annexin V和PI染色液，室溫避光孵育15 min后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1miR-152-3p對(duì)TCF4表達(dá)的影響 與SGC-7901組比較，miR-152 mimic組miR-152-3p的表達(dá)水平明顯升高 (P<0.001，圖1)，TCF4的mRNA水平顯著降低 (P<0.001，圖2)，提示miR-152-3p可靶向調(diào)控TCF4的表達(dá)。

2.2miR-152-3p與TCF4的靶向關(guān)系 生物信息預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miR-152-3p基因序列上存在連續(xù)的TCF-4結(jié)合位點(diǎn)(圖3)；同時(shí)，miR-152 mimic能顯著降低TCF4野生質(zhì)粒的熒光素酶活性(P<0.01，圖3)，結(jié)合位點(diǎn)突變后，miR-152 mimic對(duì)熒光素酶的抑制作用消失，表明miR-152-3p能靶向結(jié)合TCF4。

2.3miR-152-3p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響 如圖4 所示，miR-152 mimic組TCF4的蛋白表達(dá)水平明顯低于SGC-7901組 (P<0.01)，pc-TCF4組細(xì)胞TCF4蛋白表達(dá)水平顯著高于SGC-7901組 (P<0.01)；與miR-152 mimic組比較，mimic+pc-TCF4組細(xì)胞TCF4表達(dá)水平顯著升高 (P<0.01)，表明轉(zhuǎn)染成功；miR-152 mimic轉(zhuǎn)染細(xì)胞后 96 h，miR-152 mimic組細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯低于SGC-7901 組 (P<0.01，表1)，pc-TCF4組細(xì)胞增殖倍數(shù)與SGC-7901組比較顯著升高 (P<0.01，表1)；與miR-152 mimic組比較，mimic + pc-TCF4組SGC-7901細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯升高 (P<0.01，表1)，表明miR-152-3p能通過(guò)靶向下調(diào)TCF4表達(dá)抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖。

圖1 miR-152 mimic對(duì)miR-152-3p表達(dá)的影響Fig.1 Effect of miR-152 mimic on expression of miR-152-3pNote: The expression of miR-152-3p was measured by RT-PCR.n=6,***.P<0.001 versus mimic-scramble.

圖2 miR-152-3p對(duì)SGC-7901細(xì)胞TCF4表達(dá)的影響Fig.2 Effect of miR-152-3p on expression of TCF4 in SGC-7901 cellsNote: The mRNA level of TCF4 was determined by RT-PCR.n=6,***.P<0.001 versus mimic-scramble.

2.4miR-152-3p對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響 流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-152 mimic能顯著升高SGC-7901細(xì)胞的凋亡率 (P<0.01，圖5)，pc-TCF4能顯著降低SGC-7901細(xì)胞凋亡率 (P<0.01，圖5)，與SGC-7901 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；mimic + pc-TCF4組細(xì)胞凋亡率顯著低于miR-152 mimic組 (P<0.01，圖5)，提示miR-152-3p能通過(guò)靶向TCF4誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡。

圖3 miR-152-3p與TCF4的靶向關(guān)系Fig.3 Targeted-relationship of miR-152-3p and TCF4Note: Bioinformatics prediction and luciferase reporter assay were performed for conforming the relationship of miR-152-3p and TCF-4.n=6,**.P<0.01 versus TCF4 WT group.

圖4 pc-TCF4對(duì)SGC-7901細(xì)胞TCF4蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of pc-TCF4 on protein level of TCF4 in SGC-7901 cellsNote: The protein level of TCF4 was determined by Western blot.n=6,*.P<0.05 versus miR-152 mimic group，**.P<0.01 versus SGC-7901 group.

表1miR-152-3p對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響

Tab.1EffectofmiR-152-3ponproliferationofSGC-7901cells

Groups0 h24 h48 h72 h96 hSGC-79011.00±0.001.30±0.203.20±0.154.40±0.304.80±0.35miR-152 mimic1.00±0.001.14±0.342.00±0.302.70±0.453.10±0.301)pc-TCF41.00±0.001.70±0.253.50±0.355.30±0.306.40±0.451)mimic+pc-TCF41.00±0.001.34±0.343.40±0.254.20±0.454.70±0.302)

Note：n=6,1)P<0.01 versus SGC-7901 group;2)P<0.05 versus miR-152 mimic group.

圖5 miR-152-3p對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of miR-152-3p on cell apoptosis of SGC-7901 cellsNote: Flow cytometry was employed to measure apoptosis rate of SGC-7901 cells.n=6,*.P<0.05 versus miR-152 mimic group；**.P<0.01 versus SGC-7901 group.

3 討論

研究表明，微小型RNA (microRNAs,miRNAs)在維持基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)平衡和調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、分化等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[11]。miRNAs表達(dá)異?？蓪?dǎo)致疾病的發(fā)生，尤其是癌癥[12]。miR-152-3p是miR-148/miR-152家族成員，大量研究表明，miR-152-3p在多類癌癥中表達(dá)水平降低，具有抑制癌癥發(fā)展的作用，如甲狀腺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等[13-15]。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，miRNAs能調(diào)控人類三分之一的蛋白質(zhì)表達(dá)，可通過(guò)調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)影響癌癥的發(fā)展[16]。Ma等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-152能通過(guò)靶向調(diào)控E2F轉(zhuǎn)錄因子3的表達(dá)抑制人骨肉瘤細(xì)胞增殖。Huang等[18]的研究表明，miR-152在HBV誘導(dǎo)的肝癌組織中表達(dá)水平明顯低于正常肝組織，miR-152表達(dá)下調(diào)能靶向抑制DNMT1的表達(dá)，導(dǎo)致DNA異常甲基化。在前列腺癌中，miR-152還能通過(guò)靶向TGF-α抑制前列腺癌細(xì)胞發(fā)生侵襲和遷移[19]。TCF-4是Wnt信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)蛋白，其高表達(dá)可促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展[20]。GU等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，TCF4是miR-139的下游靶蛋白，miR-139可通過(guò)靶向TCF4調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖和凋亡。已有研究表明miR-152-3p能影響胃癌的發(fā)展，但miR-152-3p能否通過(guò)靶向TCF4影響胃癌的發(fā)展還未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本研究首先利用miR-152 mimic上調(diào)胃癌細(xì)胞SGC-7901的miR-152-3p的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-152-3p表達(dá)能顯著下調(diào)TCF4的mRNA水平，提示miR-152-3p可能靶向調(diào)控胃癌SGC-7901細(xì)胞TCF4的表達(dá)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-152-3p能顯著抑制TCF4野生質(zhì)粒的熒光素酶活性，進(jìn)一步表明miR-152-3p可靶向調(diào)控胃癌SGC-7901細(xì)胞TCF4的表達(dá)。

調(diào)控癌細(xì)胞增殖是miRNAs調(diào)控癌癥發(fā)展的重要機(jī)制。Guoping等[21]研究表明，miR-143在胃癌患者組織和細(xì)胞中均呈低表達(dá)狀態(tài)，上調(diào)miR-143表達(dá)能通過(guò)抑制GATA6的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。miR-168的異常表達(dá)與胃癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期分布及癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)，機(jī)制與靶向抑制SOX2表達(dá)有關(guān)[22]。此外，Zhai等[23]的研究表明，miR-152能抑制多種胃癌細(xì)胞增殖和遷移，作用機(jī)制與抑制CD151的表達(dá)有關(guān)。本文研究也發(fā)現(xiàn)，miR-152 mimic轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞后96 h，細(xì)胞增殖速度明顯降低，進(jìn)一步表明miR-152-3p能抑制胃癌細(xì)胞增殖。同時(shí)，上調(diào)TCF4表達(dá)后，SGC-7901細(xì)胞增殖速度明顯上升，TCF4還能顯著減弱miR-152 mimic對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用，表明TCF4能促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，miR-152-3p能通過(guò)靶向抑制TCF4表達(dá)降低胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖速度。

細(xì)胞凋亡抑制是癌癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。研究表明，在胃癌中，細(xì)胞凋亡明顯被抑制，作用機(jī)制與miRNAs的異常表達(dá)有關(guān)。miR-185在胃癌患者的腫瘤組織中表達(dá)水平降低，上調(diào)miR-185表達(dá)能通過(guò)調(diào)控caspase-3、caspase-8、Bcl-2及Bax的表達(dá)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[24]。miR-329在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)被抑制，上調(diào)miR-329表達(dá)能靶向抑制KDM1A表達(dá)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[25]。本文研究發(fā)現(xiàn)，miR-152-3p能顯著升高胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡率，表明miR-152-3p 能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。同時(shí)，pc-TCF4能抑制SGC-7901細(xì)胞凋亡并能減弱miR-152 mimic對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，提示miR-152-3p能促進(jìn)胃癌SGC-7901細(xì)胞，作用機(jī)制與下調(diào)TCF4表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，miR-152 mimic能抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞TCF4表達(dá)并能降低TCF4野生質(zhì)粒的熒光素酶活性，表明miR-152-3p能靶向調(diào)控TCF4表達(dá)；同時(shí)，miR-152-3p還能顯著降低SGC-7901細(xì)胞增殖倍數(shù)、升高細(xì)胞凋亡率，pc-TCF4能顯著減弱miR-152-3p對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用，提示miR-152-3p能通過(guò)靶向TCF4抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本文進(jìn)一步探討了miR-152-3p調(diào)控胃癌發(fā)展的作用機(jī)制，后期將通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證本文研究結(jié)果，以期為miR-152-3p用于胃癌的診斷及治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。