阿爾茨海默病患者血清及尿液中外泌體的提取鑒定

周穎，王周凡，朱焰，王愛(ài)民，陳娟，洪輝，陸微微

(1南華大學(xué)附屬長(zhǎng)沙醫(yī)院/長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院，長(zhǎng)沙410005；2湘潭市中心醫(yī)院)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種以進(jìn)行性記憶力減退、認(rèn)知功能障礙及人格改變?yōu)橹饕卣鞯闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)退行性疾病。外泌體是一種由體內(nèi)多種類(lèi)型細(xì)胞主動(dòng)分泌的大小均一、直徑30～150 nm的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)囊泡，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂類(lèi)以及RNA，可在大多數(shù)體液中檢測(cè)到[1]。外泌體是一種細(xì)胞間信息傳遞媒介，可運(yùn)載的生物活性分子種類(lèi)繁多，涵蓋了蛋白質(zhì)、mRNA、microRNA、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子受體等多種生物活性物質(zhì)，參與細(xì)胞的生理及病理過(guò)程。本研究采用ExoQuick試劑盒提取AD患者血清和尿液中的外泌體，并通過(guò)電鏡觀(guān)察及外泌體表面標(biāo)志物CD63的檢測(cè)進(jìn)行鑒定，試圖從AD患者血清和尿液中提取外泌體，為外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 低溫高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)，透射電鏡(日本HITACHI公司)，電泳儀電源、垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠(chǎng))，ExoQuick-TC、ExoQuick Exosome Precipitation Solution(美國(guó)SBI公司)，兔抗CD63(53 kD)、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(美國(guó)SBI公司)，兔多抗GAPDH(杭州賢至生物有限公司)，BSA：牛血清蛋白(碧云天公司)，ECL底物液(美國(guó)Thermo公司)，X線(xiàn)膠片(日本柯達(dá)公司)，顯影定影試劑盒(天津市漢中攝影材料廠(chǎng))。

1.2 血清及尿液收集 南華大學(xué)附屬長(zhǎng)沙醫(yī)院2017年1～6月收治散發(fā)型AD患者20例，在滿(mǎn)足納入/排除標(biāo)準(zhǔn)[2]并簽署知情同意書(shū)、經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后成為本項(xiàng)研究的研究對(duì)象，隨機(jī)抽取6例AD患者納入血清及尿液外泌體提取對(duì)象。取其中3例AD患者空腹(至少禁食12 h)外周靜脈血5～10 mL，置血清分離膠試管中,室溫靜置30 min后,4 ℃、3 000 g離心5 min,取上層淡黃色血清,于冰上分裝于1.5 mL的EP管后置于-80 ℃冰箱備用。取另3例AD患者的中段晨尿15 mL，置20 mL試管中，并在2 h內(nèi)置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血清及尿液外泌體的提取 ①血清外泌體的提?。簩⒀鍢?biāo)本3 000 g離心5 min,收集上清，去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。將上清轉(zhuǎn)移到新管里，加入適量的ExoQuick(250 μL血清加入63 μL的ExoQuick)，混勻，4 ℃孵育30 min，將混合物1 500 g離心30 min；棄掉上清，1 500 g離心5 min，小心去除上清，得到的底部沉淀即為外泌體；加入100～500 μL的PBS重懸沉淀，得到外泌體溶液。②尿液外泌體的提?。簩⒛蛞簶?biāo)本3 000 g離心5 min，收集上清，去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。將上清轉(zhuǎn)移到新管里，加入適量的ExoQuick-TC(5 mL尿液加入1mL的ExoQuick-TC)，混勻，4 ℃孵育過(guò)夜(時(shí)間不少于12 h)，將混合物1 500 g離心30 min；棄掉上清，1 500 g離心5 min，小心去除上清，得到的底部沉淀即為外泌體；加入100 μL的PBS重懸沉淀，得到外泌體溶液。

1.4 血清及尿液外泌體蛋白定量檢測(cè) 將上述提取的外泌體樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋(樣品各取2 μL，分別與18 μL的PBS 混合)。將BSA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋?zhuān)瞥蓾舛确謩e為1、0.8、0.6、0.4、0.2 μg/μL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，分別加入96孔板內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品各設(shè)2個(gè)平行孔，待測(cè)樣品設(shè)3個(gè)平行孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔內(nèi)加入標(biāo)準(zhǔn)品BSA溶液20 μL，待測(cè)孔加入待測(cè)外泌體溶液20 μL。加入PBS的2個(gè)平行孔為空白對(duì)照。按50∶1的比例將BCA試劑盒中A液和B液進(jìn)行混合，將混合液加入96孔板內(nèi)，每孔200 μL。將外泌體蛋白及BCA試劑盒中A、B混合液于37 ℃避光孵育30 min。用DG-3022A酶標(biāo)儀測(cè)定所有孔的OD568值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度和待測(cè)樣品的OD568值作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖并得出回歸方程，根據(jù)外泌體蛋白的OD568值，利用回歸方程計(jì)算出血清及尿液中外泌體蛋白濃度。

1.5 外泌體的鑒定 ①外泌體形態(tài)的透射電鏡觀(guān)察：將上述提取的外泌體用2.5%的戊二醛及磷酸緩沖液(戊二醛用PBS稀釋成2.5%,pH 7.4)4 ℃固定4 h。再用磷酸緩沖液漂洗3次，每次15 min，1%鋨酸及磷酸緩沖液室溫固定2 h，再漂洗3次，每次15 min。然后先后用60%、70%、80%、90%、95%、100%、100%的酒精脫水，每次15 min。滲透：按1∶1的體積比例將丙酮與812包埋劑制成混合液對(duì)外泌體進(jìn)行滲透過(guò)夜，然后純812包埋劑滲透過(guò)夜。包埋：將滲透的外泌體60 ℃聚合48 h。切片：將包埋的外泌體60～80 nm超薄切片。染色：將外泌體切片鈾鉛雙染色(2%醋酸鈾飽和水溶液，枸櫞酸鉛，各染色15 min)，室溫干燥過(guò)夜后電鏡觀(guān)察。②外泌體特異性分子標(biāo)志蛋白CD63的檢測(cè)：采用Western blotting法。將外泌體蛋白樣品和Marker(外購(gòu)的商業(yè)化產(chǎn)品)加入上樣孔，用10%的SDS-PAGE膠電泳分離，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，用含5% 脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h，分別加外泌體標(biāo)準(zhǔn)抗體CD63(1∶1 000稀釋)及抗體GAPDH(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。洗去多余一抗，用封閉液稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗，將PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃搖床孵育2 h。洗去多余二抗，ELC法顯影曝光，用BandScan分析膠片灰度值。

2 結(jié)果

2.1 血清及尿液樣本中外泌體總蛋白濃度 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度和待測(cè)樣品的OD568值所作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖后得到回歸方程Y=0.511 5X+0.038 2 ，R2=0.999 3，以此計(jì)算得出3例AD患者的血清樣本中外泌體蛋白濃度分別為5.206、3.955、4.268 mg/mL，3例AD患者的尿液樣本中外泌體蛋白濃度分別為1.811、1.348、1.133 mg/mL。

2.2 外泌體形態(tài) 從AD患者血清及尿液中提取到的外泌體大小較均一，呈較典型的圓形或者橢圓形單層囊泡結(jié)構(gòu)，直徑30～150 nm，有完整脂質(zhì)包膜，見(jiàn)圖1。

注：圖A為血清中外泌體，直徑30～50 nm,背景欠清晰；圖B為尿液中外泌體，直徑50～150 nm，背景較清晰。

圖1AD患者血清及尿液中提取的外泌體在透射電鏡下的形態(tài)

2.3 外泌體特異性分子標(biāo)志物CD63檢測(cè)結(jié)果 AD患者血清及尿液中外泌體均表達(dá)CD63，見(jiàn)圖2。3例AD患者血清中外泌體CD63灰度值分別為22 171 837、32 043 050、40 688 491，3例AD患者尿液中外泌體CD63灰度值分別為40 389 779、30 241 742、49 143 331。

注：所提取外泌體蛋白均表達(dá)CD63。U代表尿液，Marker為標(biāo)記，B代表血清。

圖23例AD患者血清外泌體蛋白及3例AD患者尿液外泌體蛋白的CD63免疫印跡條帶

3 討論

目前所使用的 AD 診斷標(biāo)準(zhǔn)都是以臨床表現(xiàn)為基礎(chǔ)，結(jié)合病史、精神狀態(tài)、認(rèn)知和心理學(xué)檢查結(jié)果，并除外其他可能導(dǎo)致癡呆的疾病[3]。但事實(shí)上AD的病理改變?cè)?AD 臨床癥狀出現(xiàn)之前已經(jīng)發(fā)生了多年。2011年[2]發(fā)表的AD標(biāo)準(zhǔn)(NIA-AA)納入了生物標(biāo)志物，即功能影像學(xué)顯示特殊腦區(qū)皮層葡萄糖代謝率下降或 Aβ42表達(dá)降低和(或)tau蛋白表達(dá)升高，然而由于受到資源和操作程序等因素的限制，生物標(biāo)志物不能廣泛運(yùn)用于 AD 的診斷性篩查。

外泌體作為膜性小囊泡，可以由神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌，與受體細(xì)胞結(jié)合并被內(nèi)吞入細(xì)胞內(nèi)，然后再與胞內(nèi)體胞膜融合，調(diào)控分選疾病相關(guān)蛋白，從而影響疾病進(jìn)程[4]。研究[5]表明，外泌體在神經(jīng)發(fā)育和再生、皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元突觸可塑性方面都發(fā)揮重要的作用，而且具有免疫刺激特性，在病理刺激或受損傷情況下活化和傳播炎癥反應(yīng)。外泌體越來(lái)越多的被證明參與細(xì)胞間信號(hào)傳遞，其將一些有功能的蛋白、DNA和RNA傳遞給其他細(xì)胞，以改變接受細(xì)胞的生物學(xué)活性[6]。有研究[7]證明AD患者的β-淀粉樣蛋白中含有大量與外泌體相關(guān)的蛋白，且被認(rèn)為與AD發(fā)病相關(guān)。2011年Alvarez等[8]首次成功利用外泌體治療大鼠AD，顯著下調(diào)了AD相關(guān)蛋白的表達(dá)(下降了62%)，減少了β-淀粉樣蛋白的沉積。外泌體還可以作為AD患者清除體內(nèi)β-淀粉樣蛋白的主要載體[9]。

由于外泌體形態(tài)小，易透過(guò)血腦屏障[10]，并隨液體流動(dòng)至全身而不易被吞噬細(xì)胞吞噬，因此不同來(lái)源的外泌體可在血液、腦脊液、尿液等體液中檢出。外泌體提取的方法有超高速離心法、過(guò)濾離心法、密度梯度離心法、免疫磁珠法和試劑盒提取法等[11]，但沒(méi)有一種方法能同時(shí)保證外泌體的含量、純度、生物活性。超高速離心法操作耗時(shí)長(zhǎng),且得到的外泌體樣本純度不夠[12]。密度梯度離心法能夠獲得高純度的外泌體，但是由于操作過(guò)程繁瑣、難度較大，不適用于外泌體的大量提取[13]。近年來(lái)，超濾法及聚乙二醇沉淀法等新的方法用于外泌體的分離提純，也取得了不錯(cuò)的效果。本研究采用免疫沉淀法(ExoQuick 試劑法)成功從AD患者血清和尿液中提取外泌體，血清中提取的外泌體背景較模糊，而尿液中較清晰，考慮血清中混雜干擾因素較多。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將繼續(xù)尋找差異表達(dá)的外泌體蛋白，為AD的診斷和治療提供理論依據(jù)。