王永宏 孫雙春 延育強(qiáng) 崔曉剛 王 瑞*

地佐辛(dezocine)是一種新型的鎮(zhèn)痛藥，是κ受體激動(dòng)劑，也是μ受體拮抗劑[1]。地佐辛是苯嗎啡烷類衍生物，不良反應(yīng)低，無(wú)明顯依賴性。目前，對(duì)地佐辛的藥理機(jī)制尚未完全明確。星形膠質(zhì)細(xì)胞屬于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的一種，具有神經(jīng)元保護(hù)的功能、為神經(jīng)元提供營(yíng)養(yǎng)和代謝的保證，并且參與突觸的形成[2]。

麻醉藥對(duì)于神經(jīng)元的影響與星形膠質(zhì)細(xì)胞有著密切的關(guān)系[3-4]。本研究通過(guò)檢測(cè)大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)表達(dá)，探討地佐辛對(duì)大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SD大鼠的乳鼠(出生0～1 d)10只，無(wú)任何頸部或頭部淤血，大鼠乳鼠均購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)：SCXK(閩)2017-0002。

1.2 儀器與試劑

(1)儀器設(shè)備。Olympus BX5lTRF型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；ELX-808IU型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；ALLEGRA X-12型離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；3111型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo/Forma公司)。

(2)試劑。一抗GFAP(上海古朵生物科技有限公司)；驢抗兔IgG二抗(武漢艾美捷科技有限公司)；牛血清白蛋白試劑(北京百奧萊博科技有限公司)；DAPI染劑(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)

選取SD大鼠的乳鼠，將其固定后，使用酒精在手術(shù)區(qū)皮膚處消毒，超凈工作臺(tái)中迅速地將乳鼠腦袋剝離，并置于事先配好的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)中，pH=7.4。使用鑷子提取皮層，分離血管膜后置于PBS中，加入胰酶1 ml，于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置消化15 min后加入2 ml的完全培養(yǎng)基終止消化。以3500 r/min離心15 min，離心后調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/cm2，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每?jī)扇論Q液1次。培養(yǎng)9 d后搖床中過(guò)夜(180 r/m，37 ℃)，15 h后收集離心沉淀。

1.3.2 比色法檢測(cè)細(xì)胞活性

配制5 mg/ml的四甲基偶氮唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色試劑儲(chǔ)存溶液待用，于-20 ℃保存。將SD大鼠的乳鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞接種于24孔板中，每孔加入40 μl的MTT溶液于400 μl完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱中孵育3 h。每孔加入100 μl的Formanzan溶解液，恒溫?fù)u床上培養(yǎng)1 h(120 r/min，37 ℃)。使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(595 nm)。

1.3.3 免疫熒光法檢測(cè)GFAP表達(dá)

石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，微波修復(fù)2次，將切片使用3%牛血清白蛋白（BSA）封閉1 h處理，然后分別滴加1∶50一抗GFAP，PBS沖洗3次后，滴加生物素標(biāo)記的驢抗兔IgG二抗工作液，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次。用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色處理，自來(lái)水沖洗，用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)復(fù)染液復(fù)染；防蛻變水性封片劑封片。使用Olympus BX5lTRF熒光顯微鏡，將樣片置于400倍鏡下觀察[5]。

1.3.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

取經(jīng)滅菌處理的玻片置于培養(yǎng)皿內(nèi)，將星形膠質(zhì)細(xì)胞種于玻片上，培養(yǎng)24 h后使用槍頭輕輕的在玻片上快速劃一條劃痕，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)光學(xué)顯微鏡觀察拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞活性比較

對(duì)照組細(xì)胞活性光密度(optical density，OD)值明顯高于低劑量組、中劑量組和高劑量組；高劑量組細(xì)胞活性O(shè)D值明顯低于低劑量組和中劑量組，對(duì)照組細(xì)胞活性O(shè)D值與其他3組比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.144，P＜0.05)，見表1。

表1 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞活性O(shè)D值比較(±s)

表1 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞活性O(shè)D值比較(±s)

低劑量組 0.902±0.124中劑量組 0.654±0.110高劑量組 0.357±0.108組別 OD值 F值 P值對(duì)照組 1.001±0.010 12.144 ＜0.05

2.2 各組GFAP熒光強(qiáng)度比較

對(duì)照組GFAP熒光強(qiáng)度明顯高于低劑量組、中劑量組和高劑量組；高劑量組GFAP熒光強(qiáng)度明顯低于低劑量組和中劑量組，對(duì)照組GFAP熒光強(qiáng)度與其他3組比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=84.645，P＜0.05)，見表2，如圖1所示。

表2 各組GFAP熒光強(qiáng)度比較(±s)

表2 各組GFAP熒光強(qiáng)度比較(±s)

低劑量組 15.241±1.503中劑量組 10.528±1.311高劑量組 5.249±0.977組別 熒光強(qiáng)度 F值 P值對(duì)照組 18.122±1.241 84.645 ＜0.05

圖1 GFAP免疫熒光染色圖

2.3 各組細(xì)胞遷移情況比較

對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)明顯高于低劑量組、中劑量組和高劑量組；高劑量組遷移細(xì)胞數(shù)明顯低于低劑量組和中劑量組，對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)與其他3組比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=110.467，P＜0.05)，見表3，如圖2所示。

表3 各組遷移細(xì)胞數(shù)比較(±s)

表3 各組遷移細(xì)胞數(shù)比較(±s)

低劑量組 23.36±3.8中劑量組 13.41±4.10高劑量組 3.20±1.03組別 遷移細(xì)胞數(shù)(個(gè)) F值 P值對(duì)照組 30.24±3.55 110.467 ＜0.05

圖2 各組細(xì)胞遷移圖

3 討論

神經(jīng)性疼痛(neuropathic pain，NPP)指的是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病而直接造成的疼痛[6]。NPP疼痛表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、痛覺過(guò)敏、異常疼痛和感覺異常等。臨床調(diào)查顯示，NPP患病率約為3.3%～8.2%[7]。NPP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全明確，病因包括從物理、化學(xué)損傷到代謝性復(fù)合性神經(jīng)病變。因此針對(duì)NPP臨床上缺乏有效的治療手段，在對(duì)NPP機(jī)制進(jìn)行研究時(shí)，主要構(gòu)建動(dòng)物模型。星形膠質(zhì)細(xì)胞屬于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的一種，主要具有神經(jīng)元保護(hù)的功能。目前，星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的關(guān)系已成為神經(jīng)生物學(xué)中的熱點(diǎn)。神經(jīng)元是主要調(diào)節(jié)大腦功能的細(xì)胞，可以釋放多種遞質(zhì)等影響突觸活動(dòng)[8]。有研究顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞參與神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的活性調(diào)節(jié)[9]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證實(shí)，膠質(zhì)細(xì)胞與NPP存在相關(guān)性。王伍超等[10]研究認(rèn)為，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化后，主導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)免疫反應(yīng)，在NPP發(fā)生和維持中發(fā)揮重要作用。神經(jīng)損傷后，外周至中樞的膠質(zhì)細(xì)胞活化釋放許多細(xì)胞因子及炎性因子，促進(jìn)了NPP。因此，調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞功能可能是研究NPP的一個(gè)新方向。

地佐辛是阿片受體混合激動(dòng)-拈抗劑，是κ受體激動(dòng)劑，也是μ受體拮抗劑，具有鎮(zhèn)痛作用，同時(shí)又拮抗μ受體，因此成癮性較小，呼吸抑制作用較弱。地佐辛在人體內(nèi)吸收，且分布迅速，因此地佐辛鎮(zhèn)痛起效快、鎮(zhèn)痛時(shí)間持久[11]。臨床上地佐辛廣泛應(yīng)用于全麻誘導(dǎo)、術(shù)后鎮(zhèn)痛、超前鎮(zhèn)痛等[12]。Welch等[13]研究發(fā)現(xiàn)，建立坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷大鼠模型，并給予一定劑量的嗎啡后，可以顯著降低大鼠術(shù)后的機(jī)械性縮足反射閾值。因此，推測(cè)地佐辛可能也具有類似的作用，但是地佐辛對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及遷移有無(wú)影響尚有待進(jìn)一步研究。

GFAP是膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白和主要的骨架成分[14]。研究顯示，GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞合成必要的骨架蛋白，并且僅存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞體中[15-16]。GFAP可反映星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的狀態(tài)，因此可利用GFAP的特異性抗體來(lái)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞。本研究通過(guò)提取SD大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，并給予不同劑量的地佐辛，檢測(cè)GFAP表達(dá)和細(xì)胞遷移情況，探討地佐辛對(duì)大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響，為臨床治療NPP提供理論依據(jù)。GFAP表達(dá)上調(diào)的程度代表星形膠質(zhì)細(xì)胞增生活躍程度，本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞活性O(shè)D值、GFAP熒光強(qiáng)度值和遷移細(xì)胞數(shù)明顯高于低劑量組、中劑量組和高劑量組；表明地佐辛可抑制大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達(dá)、并抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育，還可抑制大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及遷移。同時(shí)，隨著地佐辛劑量的增加，細(xì)胞活性O(shè)D值、GFAP熒光強(qiáng)度值和遷移細(xì)胞數(shù)顯著降低；其結(jié)果表明，佐辛發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用可能與抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化有密切關(guān)聯(lián)。因此本研究推測(cè)，地佐辛發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的同時(shí)，也可以抑制脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。

地佐辛可抑制大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及遷移，下調(diào)GFAP的表達(dá)，但是NPP的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，值得進(jìn)一步探索地佐辛在治療NPP的作用及其機(jī)制。