孫 池，張 波，何義亮

(上海交通大學環(huán)境科學與工程學院，上海 200240)

納米顆粒物是指至少在一維上尺寸為1～100 nm的晶態(tài)或無定型物質(zhì)，其環(huán)境行為近年來引起了環(huán)境學領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[1-3]。由于巨大的比表面積和表面活性，納米顆粒極易與水中的污染物相結(jié)合,從而大大增強污染物在水環(huán)境中的遷移能力[4-6],因此,納米顆粒物被認為是影響環(huán)境中化學污染物遷移和生物利用度的關(guān)鍵因素之一[7-8]。納米顆粒的尺寸效應使納米顆粒更容易進入水生生物體內(nèi)并富集，進而進入到食物鏈中[9]。納米顆粒物的自由基氧化損傷及氧化應激效應，會對生物體造成細胞破裂、蛋白質(zhì)變形、干擾基因表達、加快機體衰老等[10-12]危害，因此,其存在本身就會對生物體產(chǎn)生威脅[13-14]。

污水的排放是水體內(nèi)眾多污染物的重要來源，研究污水中納米顆粒物與污染物的相互作用及納米顆粒物本身的危害具有重要意義。納米顆粒物的分離通常是研究納米顆粒的首要步驟。在環(huán)境領(lǐng)域中，納米顆粒物分離后，通常會對其在不同粒徑范圍內(nèi)的組分差別及與其他污染物的相互作用等問題進行研究，因此需要找到一種能準確表征和分離顆粒物，且對顆粒物本身不造成損傷的分離技術(shù)[15-17]。傳統(tǒng)分離方法中，萃取法會在納米顆粒物中混入有機溶劑[18]，對納米顆粒物造成污染；電泳法需要在分離過程中加入表面活性劑，活性劑會部分吸附在納米顆粒物表面，從而影響顆粒物結(jié)構(gòu)[19-20]；色譜法采用有機溶劑作為流動相，會對納米顆粒物結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定程度的破壞[21-23]。上述3種方法都很難對不同粒徑級別的納米顆粒物實現(xiàn)分離。傳統(tǒng)的顆粒物粒徑表征技術(shù)有掃描電鏡(SEM)和動態(tài)光散射(DLS)。SEM由于觀察區(qū)域小，檢測的顆粒粒徑不具有統(tǒng)計學意義，且拍攝前樣品的干燥處理會對樣品造成一定程度的損傷；動態(tài)光散射(DLS)技術(shù)中，大顆粒布朗運動的緩慢性會使散射光斑產(chǎn)生緩慢波動，對大顆粒物的粒徑表征誤差較大；非對稱流場流分離技術(shù)采用流體力學原理，較傳統(tǒng)顆粒物粒徑表征技術(shù)具有更高的準確度和最大程度保留樣品特性的優(yōu)點[24]。該技術(shù)是一種采用開放式通道的尺寸分級技術(shù)，可以根據(jù)擴散系數(shù)的差異分離顆粒物[25]。 AF4在分離不同尺寸的顆粒物時幾乎是一種通用型方法，在一定的參數(shù)設(shè)置并采用不同洗脫溶劑的條件下可分離1～500 nm的聚集體，其流動相允許使用離子強度高達10 mmol/L的去離子水或緩沖水溶液[25]，而不添加其他如表面活性劑等流動相改性劑，因此不會影響顆粒尺寸和表面電荷[26]。同時，AF4也可串聯(lián)其他的檢測設(shè)備，如UV、ICP以及顆粒物尺寸的表征設(shè)備，顯著提高了AF4的適用范圍和功能性[27-28]。目前對蛋白質(zhì)、病毒、C60、納米銀等多種標準納米顆粒物的分離表征案例較多[17,29-30]，而實際水樣中，納米顆粒物由于濃度低、成分復雜等特征，目前鮮有報道過對其分離的研究，其分離難點在于實際水樣的預處理、非對稱流場流分析儀的儀器參數(shù)設(shè)置和分離條件的選擇。

本研究采用污水廠進水作為樣品，構(gòu)建使用AF4分離污水樣品中納米顆粒物的預處理方法，考察各分離條件對分離效果的影響和分離條件的選擇優(yōu)化，以期為污水和實際水體中納米顆粒物的分離建立一套系統(tǒng)的分離方法，為后續(xù)水體中納米顆粒物的成分分析及研究納米顆粒物對污染物遷移的影響提供參考依據(jù)。

1 試驗和方法

1.1 原料和儀器

所有的溶液均采用日本HITACHI公司的超純水(18.2 MΩ·cm)配制，NaCl(分析純，國藥)，0.1 μm混合纖維素膜(KMCE0150100，Millipore，美國)，0.22 μm混合纖維素膜(KMCE02250100，Millipore，美國)，0.45 μm混合纖維素膜(KMCE04570100，Millipore，美國)，再生纖維素膜(5、10、30 kDa，Wyatt Technology Corp.，美國)，超濾杯(8400，Millipore，美國)。

本研究采用的非對稱流場流分析儀(AF4，Wyatt Technology Corp.，美國)，配置有高壓力自動進樣器。載流液通過高效液相色譜(G1311A，Agilent，美國)中的1260 Iso泵控制。樣品經(jīng)AF4分離進入MALS檢測，數(shù)據(jù)通過軟件ASTRA 6.1(Wyatt Technology Corp.，美國)收集處理。

1.2 水樣的采集與預處理

采集的污水來自上海某污水廠進水口，污水置于10 L聚乙烯瓶中，于4 ℃ 冷庫中儲存。污水經(jīng)0.45 μm混合纖維素膜過濾以除去污水中的懸浮物。過濾水中的納米顆粒物濃度較低，為提高檢測精度，過濾水在進入AF4前需采用超濾杯濃縮100倍，超濾膜采用10 kDa再生纖維素膜。為保證樣品處于納米級(1～100 nm)，樣品需再經(jīng)0.1 μm混合纖維素膜過濾。

1.3 AF4分離實際樣品納米顆粒物的參數(shù)優(yōu)化

AF4是由Wahlund等[31]設(shè)計的一種新型場流分離系統(tǒng)。系統(tǒng)中分離流道的外場力是垂直于流動方向上的交叉流。流道的底部是多孔選擇性滲透膜，僅允許溶劑分子通過，可以支持顆粒物在流道中的分離。如圖1所示，由于布朗運動，樣品會往分離通道的中心線方向擴散。顆粒物尺寸越小，擴散系數(shù)越大，其在流道中的位置會越靠近中心線，從而擁有較高的流速，在分離過程中被較早洗脫出來。

圖1 非對稱流場流分離原理Fig.1 Principle of Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation

樣品的凈保留時間(tR，s)與其水力學半徑(Rh，m)有關(guān)。樣品保留時間取決于其擴散系數(shù)(D，m2/s)。凈保留時間和擴散系數(shù)之間的關(guān)系為Nernst-Einstein擴散方程,如式(1)。

(1)

其中：w—分離通道的厚度，m；

Fcr—交叉流流速，mL/min；

Fout—水平流流速,mL/min。

在擴散系數(shù)已知的情況下，水力學半徑可通過Stokes-Einstein方程計算,如式(2)。

(2)

其中：kB—Boltzmann常數(shù)，J/K；

T—絕對溫度，K；

η—載流液的動力學黏度，Pa·s。

水力學半徑與凈保留時間的關(guān)系式(3)可以由式(1)和式(2)推導出來。

(3)

由上述非對稱場流儀的分離原理可知,進樣量、水平流速、交叉流流速和洗脫時間對分離效果有重要影響。這3個因素決定樣品峰的特征各不相同，且分離效果難以量化，并不適宜采用正交試驗決定最優(yōu)參數(shù)。本研究采用各因素逐一試驗來決定最優(yōu)分離條件。進樣量依次采用100 μL、1 mL，水平流速依次采用0.5、1、2、3 mL/min，交叉流流速依次設(shè)為0.5、1、1.5、2 mL/min，洗脫時間根據(jù)實際出峰情況選定。其他條件采用經(jīng)驗值或暫定值：進樣流速通常采用0.2 mL/min，進樣時間根據(jù)進樣量和進樣流速進行相應設(shè)置，聚焦流速通常采用2 mL/min,聚焦時間設(shè)為2 min,載流液濃度通常為10 mmol[32],分離膜暫用10 kDa再生纖維素膜。

1.4 分離膜孔徑的優(yōu)化

AF4常用的分離膜有再生纖維素膜和聚醚砜膜兩種，但聚醚砜膜由于穩(wěn)定性較差[16]，長期浸泡會導致膜厚度增加，從而造成分離通道厚度減小，擠壓顆粒物在通道縱向的分布空間，進而降低分離效果。在相同粒徑規(guī)格下，再生纖維素膜較聚醚砜膜價格更為低廉，且分離污水中納米顆粒物的效果相差不大。綜合考慮膜特性和經(jīng)濟性，本研究分離膜采用再生纖維素膜。本研究分別采用孔徑為5、10 kDa和30 kDa的再生纖維素膜對樣品進行分離，以選取最優(yōu)分離膜孔徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 進樣量、水平流速、交叉流速及洗脫時間的條件優(yōu)化

水平流速為0.5 mL/min，洗脫時間為50 min，交叉流速為1 mL/min時，進樣量分別為100 μL和1 mL的分離效果如圖2所示。

由圖2可知，在分離時間為10 min附近，出現(xiàn)一個峰值較小的峰。這是因為在10 min時，分離模式產(chǎn)生變化，施加了交叉流，分離通道出現(xiàn)瞬間短時的擾動，出現(xiàn)空白峰，并非是納米顆粒在此處洗脫出來。進樣量為100 μL時，樣品峰形態(tài)良好，但在進樣量為1 mL時，由于樣品顆粒物濃度較大，峰值部分已超過MALS的檢測量程，出現(xiàn)平頭峰，峰值信息缺失，因此本研究采用100 μL進樣環(huán)。部分研究需要對流出檢測器的餾分進行收集，此時較高的顆粒物濃度便于后續(xù)的分析手段對顆粒物進行表征分析，該情況下可適當稀釋樣品，同樣可以使用1 mL進樣環(huán)。

其他條件不變，水平流速為0.5、1、2、3 mL/min條件下的分離效果如圖3所示。

由圖3可知，樣品的出峰時間會隨著水平流速的增大而減小。這是由于較大的水平流速能使顆粒物較早地從分離通道中洗脫出來，從而縮短出峰時間，但水平流速大于2 mL/min時，洗脫時間不會出現(xiàn)較大變化，相反由于水平流速過大，樣品無法在聚焦階段實現(xiàn)對樣品顆粒物的完全聚集，一部分顆粒物會被提早洗脫出來，從而出現(xiàn)較高的空白峰，造成樣品峰的部分信息缺失。綜合樣品的洗脫時間和樣品峰的完整度，最優(yōu)水平流速采用2 mL/min。

在已優(yōu)化條件下，交叉流采用0.5、1、2 mL/min和4 mL/min的分離效果如圖4所示。

圖2 進樣量對分離效果的影響Fig.2 Effect of Injection Volume on Separation Efficiency

圖3 水平流流速對分離效果的影響Fig.3 Effect of Horizontal Flow Rate on Separation Efficiency

圖4 交叉流流速對分離效果的影響Fig.4 Effect of Cross Flow Rate on Separation Efficiency

圖5 分離膜孔徑對分離效果的影響Fig.5 Effect of Separation Membrane Pore Size on Separation Efficiency

由圖4可知，當交叉流從0.5 mL/min增大到2 mL/min時，樣品峰峰寬逐漸增大；當交叉流增大到4 mL/min時，樣品峰峰高出現(xiàn)明顯降低。這是因為樣品峰增大時，不同粒徑級別的顆粒物在流道中分布的差異性也會增大，顆粒物在垂直于流道方向上的分布更為分散，從而有更寬的出峰時間，但過高的交叉流流速會使部分較大尺寸的顆粒集中分布在分離膜表面，使較大尺寸顆粒物的分布差異性減小,甚至會使部分樣品黏附在半透膜上，造成膜堵塞型膜污染[33]，非但不能增加樣品峰峰寬，還會降低樣品回收率并縮短分離膜的使用壽命。因為本研究交叉流的最優(yōu)流速選用2 mL/min。

洗脫時間的設(shè)置需要保證樣品峰能完全洗脫出來，如圖4所示，樣品峰在45 min時已顯示完全，為提高分離效率，洗脫時間采用35 min。

2.2 再生纖維素膜孔徑的選用

采用2.1的優(yōu)化條件，不同孔徑分離膜的分離效果如圖5所示。

由圖5可知，采用不同孔徑的分離膜時，樣品峰無明顯區(qū)別，采用ASTRA軟件對不同粒徑的顆粒物數(shù)量濃度進行分析，結(jié)果如圖6所示。

圖6 分離膜孔徑對不同粒徑級顆粒物數(shù)量濃度的影響Fig.6 Effect of Separation Membrane Pore Size on Particle Number Density of Different Sizes

結(jié)果表明，當分離膜孔徑為30 kDa時，顆粒物在小尺寸下的數(shù)量濃度有明顯降低。這是由于在垂直于水平方向的交叉流作用下，一部分較小尺寸的顆粒物會透過分離膜被提前洗脫出來，造成顆粒物損失。在孔徑為5 kDa和10 kDa時，各孔徑級別顆粒物的數(shù)量濃度差異不大，但10 kDa分離膜價格相對5 kDa分離膜價格更低，因此本研究選擇10 kDa為再生纖維素膜的最優(yōu)分離孔徑。

3 結(jié)論與展望

3.1 結(jié)論

(1)非對稱場流儀能夠?qū)崿F(xiàn)對污水中納米顆粒的分離，分離的最優(yōu)條件：進樣量為100 μL,水平流流速為1 mL/min，交叉流流速為2 mL/min，洗脫時間為40 min，分離膜采用10 kDa再生纖維素膜。

(2)水平流流速增大，可以加速樣品的洗脫；交叉流流速增大，可以增大樣品峰峰寬；分離膜孔徑過大會使部分小尺寸顆粒損失；載流液鹽濃度增大會縮短樣品的洗脫時間。

3.2 展望

納米顆粒物的環(huán)境負效應和在環(huán)境中的大量排放引起了學術(shù)界的廣泛研究和關(guān)注。本研究聚焦于污水中的納米顆粒，并以AF4為基礎(chǔ)建立了水環(huán)境中納米顆粒的分離方法，研究了AF4的關(guān)鍵參數(shù)對水環(huán)境中納米顆粒分離的影響。納米顆粒的分離是研究納米顆粒的基礎(chǔ)，該方法不僅可以分離污水中的納米顆粒，也能實現(xiàn)實際水體中納米顆粒的分離，為后續(xù)對納米顆粒的定量、識別以及與污染物的相互作用提供重要的參考依據(jù)。