姚芝芬，于 明，朱 穎，龔正鵬

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，貴陽 550004)

據(jù)統(tǒng)計2015年我國喉癌新發(fā)病例約2.64萬人，約1.45萬人因喉癌死亡[1]。喉癌治療仍以手術(shù)為主，近年來，喉癌的治療理念已經(jīng)從根治為主轉(zhuǎn)向盡可能保留喉功能，在提高生存率的同時不斷提高患者的生活質(zhì)量[2]。因此，迫切需要新的治療靶點(diǎn)。研究顯示，接頭蛋白CrkⅡ蛋白在多種不同來源的惡性腫瘤中過表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。對于喉鱗狀細(xì)胞癌，CrkⅡ的表達(dá)及其臨床意義仍然未知。本研究主要是檢測CrkⅡ在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)，并分析CrkⅡ表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，探討CrkⅡ在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的意義，以尋求新的治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1一般資料 標(biāo)本均來自貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2006年6月至2012年10月病理科石蠟存檔標(biāo)本，經(jīng)病理科診斷為喉鱗狀細(xì)胞癌，術(shù)前均未行放療及化療。共54例，其中男53例，女1例，年齡36～73歲，平均57歲。按UICC(2002) TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期19例，Ⅱ期12例，Ⅲ期8例，Ⅳ期15例。按WHO腫瘤分型標(biāo)準(zhǔn)，病理分級為高、中、低分化各有29、20、5例。有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者12例。另22例癌旁正常組織作為對照。所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。

1.2主要試劑 兔抗人CrkⅡ多克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，DAB試劑盒及PV-6001購于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3方法 免疫組織化學(xué)鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法，抗體濃度1∶130，陽性對照為卵巢癌組織，陰性對照以PBS代替一抗。具體步驟：(1)石蠟切片置于60 ℃恒溫箱，烤片60 min；(2)二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號中分別浸泡10 min脫蠟；(3)100%、95%、80%乙醇中各浸泡5 min至水，蒸餾水洗3次，每次5 min；(4)3% H2O2水室溫孵育10 min清除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS洗3次，每次5 min；(5)抗原修復(fù)：切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液中，高壓鍋加熱至沸騰，小閥門升起后3 min，PBS洗3次，每次5 min；(6)山羊血清按1∶10稀釋、封閉、室溫孵育20 min；(7)滴加一抗，4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，每次5 min；(8)孵育二抗，37 ℃恒溫水箱20 min，PBS洗3次，每次5 min；(9)DAB顯色，在白色背景下一旦變成棕色立即自來水沖洗終止反應(yīng)，蒸餾水沖洗10 min；(10)復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.4結(jié)果判定 CrkⅡ蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá),細(xì)胞核可見少量表達(dá),因此以細(xì)胞質(zhì)或/和細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒視為陽性細(xì)胞。(1)選擇5個高倍視野(400×)計數(shù)腫瘤細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞個數(shù),得出陽性細(xì)胞百分率,≤5%計0分，6%～25%計1分,26%～50%計2分,51%～75%計3分,>75%計4分。(2)著色強(qiáng)度為多數(shù)陽性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色,細(xì)胞無染色為0分，淺棕色為1分,棕色為2分,深棕色為3分。(3)總評分：兩項評分相加，≥3分為陽性，<3分為陰性。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用率表示，比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CrkⅡ在喉癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)SP法結(jié)果示CrkⅡ在喉癌組織中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，細(xì)胞核可見少量表達(dá)，陽性率達(dá)68.5%，在癌旁正常組織中少量表達(dá)或無表達(dá)，喉癌組織CrkⅡ陽性率與癌旁正常組織比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.180，P<0.05)，見圖1、表1。

A:癌旁正常組織(×200)；B:喉癌組織(×400)

表2 CrkⅡ在喉癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.2CrkⅡ蛋白與喉鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系 喉癌組織中，CrkⅡ蛋白在中、低分化的腫瘤標(biāo)本中陽性表達(dá)率明顯高于高分化(χ2=5.172，P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ期的CrkⅡ蛋白陽性率與Ⅰ、Ⅱ期比較顯著增高(χ2=9.643，P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者CrkⅡ蛋白陽性表達(dá)率為91.7%，與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的61.9%比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.833，P<0.05)，但CrkⅡ蛋白的陽性表達(dá)率在喉癌患者各年齡組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.541，P>0.05)，見表2。

3 討 論

原癌基因Crk定位于染色體17p13.3，其表達(dá)產(chǎn)物CrkⅡ蛋白相對分子質(zhì)量為40×103，為接頭蛋白Crk家族的成員，介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用，并在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。CrkⅡ由3個Src同源(sarcoma homology,SH)結(jié)構(gòu)域組成：SH2、N-末端SH3(nSH3)和C-末端SH3(cSH3)結(jié)構(gòu)域。CrkⅡ-SH2結(jié)構(gòu)域與蛋白質(zhì)中磷酸化的酪氨酸模體結(jié)合，包括p130Cas、樁蛋白和Gab1等；CrkⅡ-nSH3結(jié)構(gòu)域與富含脯氨酸基序的蛋白相互作用，包括C3G、Dock180、c-Abl、Cbl和JNK等；CrkⅡ-cSH3是一種非典型SH3結(jié)構(gòu)域，不與脯氨酸基序結(jié)合，可反向激活A(yù)bl。這些蛋白涉及細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和細(xì)胞骨架重構(gòu)，基于這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的相互作用，CrkⅡ的作用涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲、骨架重構(gòu)等[4-5]。

CrkⅡ蛋白在胚胎和成人各組織中普遍少量表達(dá)，在多種腫瘤組織中過表達(dá),如肺癌、成膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺癌、胰腺癌和膀胱癌等，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移和侵襲[6-10]。

YAMADA等[11]用免疫組織化學(xué)檢測71例口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)標(biāo)本中CrkⅡ的表達(dá)。在正常上皮中沒有檢測到CrkⅡ的表達(dá),而在OSCC的侵襲性前緣和彌漫性侵襲性區(qū)域見CrkⅡ強(qiáng)染色。在OSCC中CrkⅡ過表達(dá)(49/71，68.1%)較正常的口腔上皮細(xì)胞(0/10，0，P<0.05)更多見。 此外，在晚期癌癥組織中CrkⅡ過度表達(dá)更明顯，如T分期中(T3/4vs. T1/2,P<0.05)，N分期中(N3/4vs. 1/2，P<0.05)和侵襲性模式中(3/4vs. 1/2，P<0.01)[12]。LIU等[9]用免疫組織化學(xué)探索CrkⅡ在胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)組織中的表達(dá)譜。在150個PDAC組織中發(fā)現(xiàn)126例高度表達(dá)CrkⅡ蛋白。而CrkⅡ蛋白在周圍的正常組織中幾乎無表達(dá)。

本研究結(jié)果顯示，CrkⅡ蛋白于喉鱗狀細(xì)胞癌組織中陽性表達(dá)率約68.5%，顯著高于癌旁正常組織，提示CrkⅡ與喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。與其他腫瘤的相關(guān)研究一致，隨著腫瘤病理分級、臨床分期的遞增及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，CrkⅡ蛋白陽性表達(dá)率和著色強(qiáng)度也在遞增。均提示CrkⅡ蛋白通過促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移在喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。CrkⅡ有望作為喉鱗狀細(xì)胞癌檢測及治療的新指標(biāo)，然而具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。