李明慧，尚一娜，霍麒文，陳 境，張曉寧，邢葉妮，楊姝玉，王俊國(guó)*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

乳酸菌真空冷凍干燥是將乳酸菌細(xì)胞懸浮液凍結(jié)后，提高真空度使冰晶在低溫條件下升華變成凍干粉狀態(tài)的技術(shù)[1]。該方法主要是依據(jù)微生物的生理、生化特點(diǎn)，使菌株的代謝處于不活潑的狀態(tài)，生長(zhǎng)和繁殖受到抑制，達(dá)到休眠的狀態(tài)，以保持菌株的原有特性[2]。真空冷凍干燥技術(shù)發(fā)明于20世紀(jì)60年代初期，現(xiàn)已在工業(yè)化生產(chǎn)中大規(guī)模使用。與其他保藏菌株的方法相比，經(jīng)過(guò)冷凍干燥技術(shù)處理后的菌株含活菌數(shù)量較高，發(fā)酵活力較好，遺傳特性較為穩(wěn)定，同時(shí)它在儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)确矫娉杀据^為低廉，因此冷凍干燥技術(shù)有助于菌體貯藏與應(yīng)用[3-4]。

但冷凍干燥也會(huì)導(dǎo)致乳酸菌菌體活力下降甚至死亡[5-6]。為了探究冷凍干燥導(dǎo)致乳酸菌發(fā)酵劑失活的機(jī)制，國(guó)內(nèi)外學(xué)者們進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)冷凍干燥后細(xì)菌的存活率以及發(fā)酵活力降低的主要原因有以下幾個(gè)方面：冷凍和干燥過(guò)程造成的細(xì)胞膜通透性增加、膜流動(dòng)性降低、細(xì)胞酶及相關(guān)蛋白質(zhì)變性和核糖核酸結(jié)構(gòu)變化等[7-8]。

盡管大量研究證明冷凍干燥會(huì)對(duì)乳酸菌的發(fā)酵活力造成一定程度上的損傷，并提出了相應(yīng)的解決辦法，但沒(méi)有對(duì)其失活機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)地分析，本文以細(xì)胞膜、酶、蛋白質(zhì)以及遺傳物質(zhì)等為主要對(duì)象，對(duì)真空冷凍干燥的損傷機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)的總結(jié)，為制備冷凍干燥高效濃縮型乳酸菌發(fā)酵劑提供一定的參考。

1 冷凍干燥對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響

1.1 冷凍干燥對(duì)細(xì)胞膜通透性的作用方式

細(xì)胞膜可以使菌體與外部環(huán)境隔離，是保護(hù)乳酸菌的主要屏障，因此膜是否完整、是否受損是冷凍干燥過(guò)程中最受關(guān)注的焦點(diǎn)[9]。

在冷凍干燥過(guò)程中，有許多因素會(huì)影響膜的通透性，進(jìn)而造成細(xì)胞膜的損傷。這主要與冷凍過(guò)程中冰晶的形成以及干燥過(guò)程中磷脂雙分子層的損傷有關(guān)。其中冰晶的形成有可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的機(jī)械損傷，這也是造成細(xì)胞死亡的主要原因。在冷凍干燥的預(yù)凍過(guò)程中，菌株內(nèi)的游離態(tài)水凍結(jié)后會(huì)形成冰晶，一般冰晶越大，細(xì)胞膜越容易破裂，細(xì)胞越容易死亡；冰晶越小，對(duì)細(xì)胞膜的機(jī)械損傷也較小[10]。同時(shí)在冷凍過(guò)程中溫度的波動(dòng)也會(huì)使胞內(nèi)冰晶發(fā)生重結(jié)晶，使冰晶變大，破壞細(xì)胞膜。

如圖1所示，在凍結(jié)過(guò)程中，凍結(jié)速率的變化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外水分含量的變化，細(xì)胞懸液以1 ℃/min的速率降溫至-20～-40 ℃，1 h左右達(dá)到凍結(jié)視為慢速凍結(jié)；而細(xì)胞懸液以10 ℃/min以上的速率降溫至-20～-40 ℃，短時(shí)間內(nèi)達(dá)到凍結(jié)視為快速凍結(jié)[11]。若冷凍速率較快，胞內(nèi)水分還來(lái)不及外滲就被凍成冰晶，會(huì)造成冰晶體積過(guò)大使細(xì)胞受到機(jī)械損傷，這種胞內(nèi)凍結(jié)形成的冰晶會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害；若冷凍速率較慢，游離水在細(xì)胞外部形成冰晶，胞內(nèi)水分則會(huì)外滲到胞外，細(xì)胞外形成的冰晶本身或冰晶形成的過(guò)程會(huì)對(duì)細(xì)胞造成較大的傷害。冷卻速率的緩慢或快速是相對(duì)的，并且不同的菌株所需的凍結(jié)速率有所不同，因此針對(duì)不同菌株應(yīng)選用最適于該菌株的凍結(jié)速率。采用最適凍結(jié)速率進(jìn)行冷凍時(shí)，雖然菌體細(xì)胞內(nèi)的水分會(huì)滲透到細(xì)胞外，但細(xì)胞體積收縮較小，結(jié)構(gòu)仍與原來(lái)相似，且降低了菌體細(xì)胞的發(fā)酵活性，因此對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的傷害遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于大量水分在胞內(nèi)凍結(jié)所產(chǎn)生的傷害[12]。

圖 1 凍結(jié)速率對(duì)冰晶形成的影響[13]Fig. 1 Effect of freezing rate on crystal growth[13]

除此之外，冰晶對(duì)乳酸菌的影響還與菌體的形狀有關(guān)。通過(guò)對(duì)比相同條件下的球菌和桿菌的凍干存活率，發(fā)現(xiàn)菌體表面積越大的細(xì)胞存活率越低，而且細(xì)胞的表面積越大，在冷凍過(guò)程中形成的冰晶對(duì)膜的損傷越大[14]。

細(xì)胞膜中磷脂的極性端在一定程度上以水合形式存在，而且每個(gè)磷脂的極性端與其他磷脂分子的極性端被水分子隔開(kāi)，當(dāng)磷脂干燥脫水時(shí)，以氫鍵相連的水分子從磷脂雙分子層的頭部基團(tuán)移走，頭部位置出現(xiàn)空位，?；鶗?huì)強(qiáng)加到頭部空位上，鏈間范德華力增強(qiáng)，而且磷脂分子會(huì)由液晶相向凝膠相轉(zhuǎn)變；因此磷脂分子間可能出現(xiàn)空位，膜的滲透性加大，使細(xì)胞內(nèi)的酶泄漏及胞內(nèi)蛋白質(zhì)溶出等，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，產(chǎn)酸性能降低[15]。Basholli-Salihu等[16]通過(guò)對(duì)比冷凍和冷凍干燥的菌體活性以及細(xì)胞膜內(nèi)外酶活力發(fā)現(xiàn)，菌體經(jīng)過(guò)冷凍干燥后其酶活力及發(fā)酵活力的下降程度均高于冷凍樣品，說(shuō)明干燥過(guò)程中細(xì)胞失水造成的損傷會(huì)導(dǎo)致菌的活力進(jìn)一步下降。

前人研究發(fā)現(xiàn)冷凍干燥后保加利亞乳桿菌細(xì)胞膜的通透性出現(xiàn)損傷，細(xì)胞內(nèi)外離子發(fā)生轉(zhuǎn)移，細(xì)胞內(nèi)部的離子環(huán)境發(fā)生改變；因此可依據(jù)這種離子濃度的改變，評(píng)價(jià)細(xì)胞膜損傷的情況[1]。王飚等[17]通過(guò)特異性熒光探針?lè)y(cè)定了冷凍干燥過(guò)程中細(xì)胞膜對(duì)H+和Ca2+的通透性變化，研究了乳酸菌細(xì)胞膜在冷凍干燥過(guò)程中完整性的變化；結(jié)果顯示，與凍干前相比，凍干后細(xì)胞內(nèi)pH值明顯下降，胞內(nèi)外pH值梯度遭到了破壞，細(xì)胞膜對(duì)H+的通透性增大；另外，冷凍干燥也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外的鈣離子濃度增加，亦說(shuō)明細(xì)胞膜的通透性增大。同時(shí)有研究還發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶活力的高低能反映細(xì)胞膜通透性的改變情況，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)滲出胞外的β-半乳糖苷酶活力可判定細(xì)胞膜損傷的情況。經(jīng)研究，對(duì)比添加保護(hù)劑和未添加保護(hù)劑的胞外β-半乳糖苷酶活力，發(fā)現(xiàn)未添加保護(hù)劑的胞外β-半乳糖苷酶活力更大；說(shuō)明冷凍干燥會(huì)造成細(xì)胞膜通透性增大，造成菌體發(fā)酵活力下降[18-19]。

1.2 減少細(xì)胞膜損傷所采取的措施

近年來(lái)有學(xué)者通過(guò)調(diào)整冷凍溫度和速率減小冰晶體積，從而減輕細(xì)胞膜損傷對(duì)菌體造成的不利影響。李寶磊[19]通過(guò)測(cè)定冷凍干燥后的Streptococcus thermophilus SP1.1發(fā)酵活力，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)液氮（-196 ℃）冷凍處理后的菌體發(fā)酵活力變化最小；這是由于胞內(nèi)游離水在超高速冷凍速率下形成微晶體，減少了對(duì)細(xì)胞膜的損傷。所以選擇合適的預(yù)冷凍速率對(duì)菌體活力的提高也尤為重要。

以脫脂乳作為凍干保護(hù)劑可以穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，減少或防止冷凍干燥對(duì)細(xì)胞的損傷，而且細(xì)胞在復(fù)水時(shí)也可防止膜受到?jīng)_擊。另外在脫脂乳中添加其他成分的復(fù)合保護(hù)劑可以成倍地增強(qiáng)對(duì)菌體的保護(hù)作用。曾小群等[20]采用脫脂乳復(fù)合保護(hù)劑，制備出Lactobacillus casei凍干存活率達(dá)98.74%的高活性酸奶發(fā)酵劑。增加Ca2+與吐溫-80的添加量，可以達(dá)到維持細(xì)胞膜流動(dòng)性的作用，對(duì)菌體的凍干存活率有顯著提高作用[21]。添加甘油也可以保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，因?yàn)楦视途哂泻軓?qiáng)的親水性，能夠穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，減少或防止細(xì)胞遭受干燥脫水的損傷，并且細(xì)胞在復(fù)水時(shí)也可防止膜結(jié)構(gòu)受到?jīng)_擊[22]。

2 冷凍干燥對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響

2.1 冷凍干燥對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性的作用方式

細(xì)胞膜的流動(dòng)性對(duì)于細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞免疫、細(xì)胞分化與信息轉(zhuǎn)導(dǎo)等都有著重要意義。低溫條件下，磷脂分子由于脂酰鏈的相互靠近產(chǎn)生疏水間力，使磷脂分子呈有序的剛性狀態(tài)，即凝膠態(tài)；隨著溫度的升高，脂酰鏈因布朗運(yùn)動(dòng)加強(qiáng)而排列疏松，脂雙層呈現(xiàn)相對(duì)無(wú)序狀態(tài)，即液晶態(tài)（圖2）。兩種狀態(tài)的轉(zhuǎn)變溫度稱為相變溫度，在冷凍干燥過(guò)程中，伴隨著水分含量的減少，磷脂分子會(huì)由液晶態(tài)向凝膠態(tài)轉(zhuǎn)變，造成磷脂分子流動(dòng)性下降。膜的流動(dòng)性受磷脂分子脂酰鏈飽和度和長(zhǎng)度的影響，飽和度較高時(shí)脂鏈延展充分，更易借助范德華力相互靠近形成晶狀體列陣，同時(shí)脂酰鏈越長(zhǎng)，越易通過(guò)疏水力相互聚合成穩(wěn)定的凝膠態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性下降[23]。

圖 2 水分含量與相轉(zhuǎn)變關(guān)系圖[13]Fig. 2 Relationship between moisture content and phase transition[13]

細(xì)菌本身可以通過(guò)自我調(diào)節(jié)來(lái)克服細(xì)胞膜流動(dòng)性下降對(duì)其造成的不良影響，主要有兩個(gè)途徑：增加膽固醇在生物膜中的比例以及調(diào)節(jié)飽和/不飽和脂肪酸的比例。膽固醇對(duì)生物膜的流動(dòng)性具有雙向調(diào)節(jié)作用。當(dāng)膜的流動(dòng)性過(guò)高時(shí)，膽固醇的增加可以調(diào)節(jié)膜的流動(dòng)性和通透性，從而使膜趨于晶膠態(tài)；當(dāng)膜的流動(dòng)性過(guò)低時(shí)，膽固醇可以通過(guò)調(diào)節(jié)使磷脂分子排列更加有序，增強(qiáng)膜的流動(dòng)性[24]。

在冷凍過(guò)程中，乳酸菌可以通過(guò)乳酸脫氫酶調(diào)節(jié)飽和/不飽和脂肪酸的比例。細(xì)胞膜脂肪酸成分是影響細(xì)胞抗冷凍性的重要指標(biāo)。脂肪酸的不飽和指數(shù)決定了細(xì)胞膜的黏度和厚度，高含量的不飽和脂肪酸可以提高細(xì)胞膜對(duì)凍干的抵抗力[4]。冷凍干燥后乳酸菌細(xì)胞膜上的飽和脂肪酸含量下降，而不飽和脂肪酸含量增加；這是由于在相對(duì)低的溫度下，細(xì)胞膜中乳酸脫氫酶的活力增加，使不飽和脂肪酸含量增加，膜的流動(dòng)性增強(qiáng)，不飽和脂肪酸中順式雙鍵的存在阻止了脂肪酸分子間的整齊排列，這種排列會(huì)導(dǎo)致脂肪膜的流動(dòng)性下降[25]。

盡管不飽和脂肪酸含量的增加在冷凍過(guò)程中可以提高細(xì)胞膜的抗冷凍能力，但這些不飽和脂肪酸在有氧條件下儲(chǔ)存過(guò)程中也易發(fā)生氧化。Hansen等[26]認(rèn)為細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化會(huì)對(duì)細(xì)胞的生存機(jī)制造成很大影響。由于不飽和脂肪酸亞甲基上的氫原子較為活潑，易被自由基奪走，產(chǎn)生脂質(zhì)自由基，與氧氣結(jié)合形成脂質(zhì)過(guò)氧自由基，不斷的循環(huán)造成脂質(zhì)鏈不斷延長(zhǎng)，導(dǎo)致不飽和脂肪酸含量的減少，降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性，影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和正常生理功能；脂肪酸氧化產(chǎn)生的自由基對(duì)細(xì)胞膜的影響還體現(xiàn)在自由基引入親水基團(tuán)后降低了磷脂雙分子層的疏水性，由于脂雙層的疏水端通過(guò)疏水力的作用相互聚攏，自動(dòng)組裝成雙分子層，而疏水力的降低導(dǎo)致組裝脂雙層的驅(qū)動(dòng)力降低，使脂雙層結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定；同時(shí)自由基引入的親水基團(tuán)也會(huì)削弱磷脂雙層與內(nèi)在蛋白質(zhì)的疏水相互作用，由于細(xì)胞膜內(nèi)蛋白是通過(guò)非極性氨基酸殘基與膜脂分子的疏水作用而插入脂雙分子層中，因此疏水作用減弱使內(nèi)在蛋白（包括膜錨蛋白）的嵌入和移動(dòng)受到影響，進(jìn)而影響到細(xì)胞膜的功能，而且自由基也可以直接誘導(dǎo)DNA出現(xiàn)損傷。Kandil等[27]也認(rèn)為膜脂肪酸的氧化是造成微生物細(xì)胞在儲(chǔ)存過(guò)程中死亡最主要的原因。膜脂肪酸氧化的程度與細(xì)胞膜內(nèi)不飽和脂肪酸及飽和脂肪酸的比值有關(guān)[28]。

在冷凍干燥過(guò)程中，有些乳酸菌可以將不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀脂肪酸。Velly等[29]認(rèn)為細(xì)胞膜中的環(huán)狀脂肪酸有助于提高菌株的抗凍能力。在冷凍過(guò)程中，菌體以不飽和脂肪酸（棕櫚油酸、異油酸和油酸等）為底物快速合成環(huán)式脂肪酸，這個(gè)過(guò)程是通過(guò)對(duì)不飽和脂肪酸的一個(gè)順式雙鍵進(jìn)行環(huán)丙烷化修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Munoz-Rojas等[30]認(rèn)為細(xì)胞膜中環(huán)丙烷脂肪酸含量的增加可以提高菌體細(xì)胞膜的流動(dòng)性。而且環(huán)丙烷脂肪酸的化學(xué)性能穩(wěn)定，一旦形成，就會(huì)起到穩(wěn)定細(xì)胞膜組成成分的作用；環(huán)丙烷脂肪酸的抗氧化能力較強(qiáng)，化學(xué)反應(yīng)活性較低[31]。因此，可以推測(cè)細(xì)胞膜中環(huán)丙烷脂肪酸的積累對(duì)菌體提高抗冷脅迫能力可能具有積極的作用。

2.2 改善細(xì)胞膜流動(dòng)性的方法

研究發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)改變培養(yǎng)基成分或培養(yǎng)條件改善細(xì)胞膜的流動(dòng)性。人們發(fā)現(xiàn)在低酸環(huán)境下生長(zhǎng)的乳酸菌，在冷凍干燥時(shí)細(xì)胞膜的流動(dòng)性保持的更好。Wang Yu等[32]發(fā)現(xiàn)，低pH值條件可以有效改善膜的流動(dòng)性，使得保加利亞乳桿菌能夠更有效地抵抗冷凍傷害。Palmfeldt等[33]研究表明，培養(yǎng)基pH值為5時(shí)，羅伊氏乳桿菌有較強(qiáng)的抗冷凍性，而pH值為6時(shí)抗冷凍性較差，說(shuō)明低pH值可以增強(qiáng)菌株的抗冷凍性。此外對(duì)不飽和脂肪酸的成分進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，較低的pH值可以引起細(xì)胞內(nèi)不飽和脂肪酸的積累。Li Hua等[34]認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束時(shí)低的培養(yǎng)基pH值，更有利于合成環(huán)丙烷脂肪酸，可起到提高冷凍干燥存活率的作用。

在培養(yǎng)基中添加一些其他成分也有利于提高細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量，使細(xì)胞膜保持好的流動(dòng)性。Fonseca等[35]的研究表明，在培養(yǎng)基中添加吐溫-80可以改善乳球菌和乳桿菌的活性，增加細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的組成，從而改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性，減少冷凍干燥過(guò)程中的死亡率。

細(xì)胞膜脂肪酸氧化的后果是自由基的形成，這是細(xì)胞死亡的主要原因之一。因此為防止細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸在貯藏期間的氧化，預(yù)培養(yǎng)過(guò)程中在培養(yǎng)基中添加微量元素、VE、VC等也有利于清除自由基來(lái)減少氧化反應(yīng)。同時(shí)處理冷凍干燥樣品的過(guò)程中避免高氧、輻射、化學(xué)污染以及不良環(huán)境因素有助于減少不飽和脂肪酸的過(guò)氧化反應(yīng)。添加冷凍干燥保護(hù)劑也是在處理凍干樣品中不可或缺的一步，谷胱甘肽能夠清除掉細(xì)胞內(nèi)的自由基，是一種重要的抗氧化劑，其通過(guò)巰基與自由基結(jié)合，可直接使自由基還原成酸性物質(zhì)，從而加速自由基的排泄，并能激活多種酶從而促進(jìn)糖類、脂肪和蛋白質(zhì)代謝。

3 冷凍干燥對(duì)酶類物質(zhì)及蛋白質(zhì)的影響

3.1 冷凍干燥對(duì)酶的影響

研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)酶的活力決定了細(xì)菌的物質(zhì)、能量代謝和生長(zhǎng)速度[27]。而冷凍干燥會(huì)導(dǎo)致一些乳酸菌的酶活力顯著降低，如過(guò)氧化氫酶、乳酸脫氫酶、磷酸甘油脫氫酶、ATP酶、脂酶等，這會(huì)對(duì)菌體的活性造成影響，甚至導(dǎo)致其死亡。造成酶活力降低的主要原因是溶質(zhì)的濃縮效應(yīng)和細(xì)胞的脫水效應(yīng)。在凍干過(guò)程中，水的凍結(jié)及蒸發(fā)使得細(xì)胞間隙內(nèi)的溶質(zhì)逐漸被濃縮，電解質(zhì)的濃度隨之增加，由于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)對(duì)電解質(zhì)極為敏感，尤其是高濃度的電解質(zhì)存在時(shí)會(huì)引起蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的改變[36]，進(jìn)而導(dǎo)致酶喪失其功能，造成菌種的活力下降[37]。

冷凍干燥會(huì)使一些維持胞內(nèi)pH值的酶類失活[38]。例如，K+-ATPase可以使橫跨膜產(chǎn)生電勢(shì)，K+與H+互換，起到維持pH值梯度的作用，而冷凍干燥使K+-ATPase失去了這種作用，破壞了pH值的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致胞內(nèi)pH值的降低，從而影響了酶的活力。另外，ATP合成酶要通過(guò)質(zhì)子梯度為ATP的合成提供能量[39]；冷凍干燥后這種質(zhì)子梯度被破壞，ATP合成酶的活力減弱，對(duì)菌體細(xì)胞的生理功能造成影響。冷凍干燥造成的酶活力降低會(huì)影響乳酸菌的生長(zhǎng)，通過(guò)研究德氏乳桿菌保加利亞亞種的冷凍損傷機(jī)制，人們發(fā)現(xiàn)受凍菌體的結(jié)構(gòu)損傷引起氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的酶活力降低，合成蛋白質(zhì)的速度變慢，代謝受到影響[2]。冷凍干燥對(duì)乳酸脫氫酶也有顯著性的影響，因此可以通過(guò)測(cè)定乳酸脫氫酶的活力來(lái)探究冷凍干燥對(duì)酶造成的損傷[40]。Li Chun等[41]指出冷凍過(guò)程中乳酸脫氫酶的失活是乳酸菌損傷的一個(gè)主要因素。乳酸脫氫酶是乳酸菌代謝的關(guān)鍵酶，正常發(fā)酵過(guò)程中，乳酸脫氫酶催化丙酮酸還原為乳酸，其活力大小反映了菌株的產(chǎn)酸能力和能量代謝能力。

3.2 冷凍干燥對(duì)蛋白質(zhì)的影響

干燥過(guò)程會(huì)導(dǎo)致由脫水引起的細(xì)胞失活[42]，失水會(huì)破壞蛋白質(zhì)與水分子、細(xì)胞膜之間的相互作用力，導(dǎo)致維持蛋白質(zhì)正常三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力減弱，酶活力喪失，從而引起蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，使其喪失功能[43]。在凍干細(xì)胞內(nèi)維持一定的水分含量是非常重要的，水分含量過(guò)低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)不穩(wěn)定和失活[44]，但水分殘留過(guò)多時(shí)會(huì)引起細(xì)胞死亡。干燥后殘余水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)太高（高于5%），殘留的自由水和細(xì)胞的蛋白質(zhì)相互作用可造成蛋白質(zhì)特定構(gòu)象改變，從而影響菌體的凍干存活率。同時(shí)凍干產(chǎn)品過(guò)高的水分含量會(huì)大大降低乳酸菌的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，縮短其儲(chǔ)存期。

3.3 維持酶及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的措施

當(dāng)微生物細(xì)胞正常生理代謝出現(xiàn)異常時(shí)，大量的不利物質(zhì)積累，這會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)酶活力產(chǎn)生較大影響。為了抑制冷凍干燥過(guò)程中酶類物質(zhì)的失活及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，細(xì)胞本身會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)。低溫條件下產(chǎn)生的冷應(yīng)激蛋白和蛋白酶能提高酶類物質(zhì)的活性及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并能維持DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄、翻譯功能，降低冷凍干燥對(duì)乳酸菌的損傷。Sanders等[45]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸乳球菌在8 ℃冷應(yīng)激處理48 h后的存活率比沒(méi)有冷處理的高20%。

除了自身應(yīng)激反應(yīng)之外，當(dāng)凍干脫水時(shí)，添加含有多羥基結(jié)構(gòu)的保護(hù)劑能夠代替水分子的位置，并以“水化膜”的形式包裹在蛋白表面，從而起到維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的作用[40]。在干燥和貯藏過(guò)程中，保護(hù)劑被廣泛用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。張玉華等[46]發(fā)現(xiàn)海藻糖通過(guò)氫鍵能夠作用于蛋白質(zhì)，代替失去的水與極性基團(tuán)作用，維持菌體細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)和功能，提高菌體的凍干存活率。

4 冷凍干燥對(duì)遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響

4.1 冷凍干燥對(duì)遺傳物質(zhì)的作用方式

在冷凍干燥過(guò)程中，遺傳物質(zhì)的損傷是細(xì)胞喪失活力的重要因素之一。原核生物的遺傳物質(zhì)都是以蛋白質(zhì)包裹DNA的復(fù)合形式存在的，冷凍干燥過(guò)程會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性下降。在冷凍干燥過(guò)程中，水分含量的減少會(huì)導(dǎo)致溶質(zhì)濃度增加和電荷變化，使DNA內(nèi)部堿基對(duì)間的疏水作用減弱，影響遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性[47]。當(dāng)相對(duì)濕度降到75%時(shí)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生可逆變化，而相對(duì)濕度在65%以下時(shí)，DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)就會(huì)被破壞，從而導(dǎo)致其空間構(gòu)型發(fā)生變化。乳酸菌DNA超螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的下降會(huì)影響遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄、翻譯和DNA復(fù)制過(guò)程的破壞，進(jìn)而導(dǎo)致菌種突變體的產(chǎn)生[48]。

干燥脫水過(guò)程會(huì)造成DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基對(duì)間的氫鍵斷裂，而氫鍵斷裂會(huì)使DNA的糖苷鍵斷裂，使DNA發(fā)生脫嘌呤和脫嘧啶反應(yīng)，影響核苷酸的組成，導(dǎo)致DNA的修復(fù)酶發(fā)生錯(cuò)誤，從而影響蛋白質(zhì)和酶的活力[49]。同時(shí)過(guò)度干燥會(huì)除去細(xì)胞中的自由水、結(jié)合水以及結(jié)構(gòu)水，使其表面的親水基團(tuán)失去保護(hù)，直接和外界環(huán)境（包括O2）作用，造成DNA的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷。

為了探究冷凍干燥后D N A的結(jié)構(gòu)變化，Santivarangkna等[50]利用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)研究了真空干燥對(duì)瑞士乳桿菌細(xì)胞的影響，脫水導(dǎo)致的DNA超螺旋結(jié)構(gòu)改變是造成細(xì)胞生理?yè)p傷的主要原因之一。

4.2 提高遺傳物質(zhì)抗冷凍穩(wěn)定性的方法

為了防止DNA結(jié)構(gòu)的改變，菌體細(xì)胞在極端不利環(huán)境下，會(huì)產(chǎn)生冷凍誘導(dǎo)蛋白質(zhì)，這種蛋白有助于維持DNA超螺旋結(jié)構(gòu)，并且使細(xì)胞能更適應(yīng)低溫下的轉(zhuǎn)錄與翻譯[51]，從而提高了細(xì)胞對(duì)冷凍干燥的抵抗力。通過(guò)微膠囊包埋也可以維持乳酸菌細(xì)胞遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性，Hlaing等[52]通過(guò)傅里葉變換紅外光譜測(cè)定鼠李糖乳桿菌微膠囊細(xì)胞的光譜變化，證明微膠囊可以對(duì)菌體細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和DNA結(jié)構(gòu)起到保護(hù)作用。此外Wang Lijun等[53]也證實(shí)菊粉微膠囊可以在冷凍干燥過(guò)程中對(duì)菌體遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性起到保護(hù)作用，并有效地提高了菌體的益生作用和菌種活力。

5 結(jié) 語(yǔ)

冷凍干燥過(guò)程雖然會(huì)引起菌體的失活甚至死亡，但在乳酸菌保存方面依然起到了很大的作用，通過(guò)探究乳酸菌的失活機(jī)制，并根據(jù)菌體的生理生化特點(diǎn)采取恰當(dāng)?shù)姆椒梢蕴岣呔昕估鋬龈稍镄阅堋?/p>