周小露 ，周才富 ，劉麗明，羅學(xué)尹，李興春，周才碧*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410000；2.中共安龍縣委機(jī)要局，貴州安龍 552400；3.黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院，貴州都勻 558000）

1 前言

貴州是種茶大省，其茶葉種植面積已高達(dá)700萬(wàn)畝；其中黔南州的種植面積為150萬(wàn)畝，占貴州省茶園總面積的21%，是重要茶區(qū)之一。黔南州明確提出有機(jī)茶的發(fā)展目標(biāo)，在有機(jī)茶園的建設(shè)過(guò)程中，必須提高無(wú)害化有機(jī)肥的投入，構(gòu)建茶園動(dòng)態(tài)植保體系。然而大量使用化學(xué)肥料會(huì)帶來(lái)土壤酸化、重金屬超標(biāo)、農(nóng)藥殘留等問(wèn)題。相關(guān)研究表明，貴州茶區(qū)如：都勻茶區(qū)[1，2]pH 值 3.00~4.00；湄潭和鳳岡在 4.00~4.50；正安在 4.00~5.00，土壤大面積有酸化情況。不僅如此，茶樹缺少大量元素，植株矮小，產(chǎn)量降低等問(wèn)題也困擾著茶農(nóng)。生物有機(jī)肥制作使用的是天然原料，比如秸稈、微生物、腐殖質(zhì)等，在有效菌種發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的多種可溶性生理活性物質(zhì)，如有機(jī)酸、維生素等能被植物迅速吸收，既達(dá)到改善土壤結(jié)構(gòu)的目標(biāo)，又可降低土壤的酸化程度[3-7]，加快土壤中氮、磷等元素循環(huán)[8-11]，減少Cd等[12]重金屬的累積，有助于緩解土壤酸化趨勢(shì)[13-14]，促進(jìn)茶樹提早萌發(fā)[16]。

目前，可用于茶樹的生物有機(jī)肥較少，但使用化肥已經(jīng)對(duì)茶園造成嚴(yán)重危害，研制出可供茶樹使用的生物有機(jī)肥迫在眉睫，這就對(duì)生物技術(shù)專業(yè)的人員提出了新的市場(chǎng)研究方向。本實(shí)驗(yàn)以黔南州茶園優(yōu)質(zhì)土壤為材料，分離、純化得到優(yōu)勢(shì)菌株，并通過(guò)形態(tài)鑒定和分子鑒定，旨在于明確優(yōu)勢(shì)菌株的背景，為其在茶園專用有機(jī)肥的開發(fā)提供參考。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

（1）土樣：采集于省黔南州都勻市三江堰茶園。

（2）蔗糖：化學(xué)純，天津市密歐化學(xué)試劑有限公司。

（3）瓊脂粉：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)責(zé)任有限公司。

（4）硝酸鈉：分析純，北京化工廠。

（5）七水合硫酸鎂：分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

（6）氯化鉀：分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠。

（7）七水合硫酸亞鐵：分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

（8）磷酸二氫鉀：分析純，壽光市艾益農(nóng)生物科技有限公司。

（9）其他材料：塑封袋，記號(hào)筆，鏟子，藥匙，蒸餾水，報(bào)紙，橡皮筋，保鮮膜，標(biāo)簽紙，馬鈴薯，利馬豆粉，75%酒精。

2.2 試驗(yàn)儀器

（1）電子顯微鏡：XSP-8C，德卡精密量?jī)x有限公司；

（2）電子天平：LTI000B，常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司；

（3）恒溫培養(yǎng)箱：BHIC-250，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；

（4）超凈工作臺(tái)：SW-CYJ1FDA，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

（5）高壓蒸汽滅菌鍋：GI5M4DS，致微儀器有限公司；

（6）冰箱：BCD-2651WBSV，上海帝覽實(shí)業(yè)有限公司；

（7）其他儀器：培養(yǎng)皿，取樣袋，酒精燈，濾紙，玻璃棒，燒杯，鑷子，接種環(huán)，試管，三角瓶，量筒。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 培養(yǎng)基配備

參考周才碧[17]的方法，按試驗(yàn)要求進(jìn)行適當(dāng)修改，具體方法如下：

（1）PDA培養(yǎng)基：洋芋400 g，葡萄糖40 g，瓊脂40 g，蒸餾水2000 mL。

（2）察氏培養(yǎng)基：蔗糖30 g，硝酸鈉2 g，七水合硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，七水合硫酸亞鐵0.01 g，磷酸二氫鉀1.0 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1000 mL。

2.3.2 菌株分離

（1）采集土壤：在貴州省都勻市三江堰茶園中，挑選優(yōu)質(zhì)土壤，用鏟子挖出，裝入密封袋中，用標(biāo)簽紙貼好并編號(hào)，帶入實(shí)驗(yàn)室以便制作菌種懸液。

（2）材料消毒：防止帶回土壤被周圍環(huán)境中的菌種污染，實(shí)驗(yàn)操作要求在無(wú)菌條件下進(jìn)行。提前2h把制備的培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)所用的工具和蒸餾水（制備稀釋濃度梯度的無(wú)菌水）放入高壓滅菌鍋中滅菌，以便使用。

（3）稀釋菌懸液：取20g土壤放入三角瓶中，裝入80mL的無(wú)菌水，搖晃 20min，制備菌種原懸液；再依次稀釋得到 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度梯度的菌種懸液。

（4）涂布接種：在酒精燈周圍，用接種環(huán)蘸取兩到三滴菌種懸浮液，使用涂布法在已經(jīng)配好的培養(yǎng)基中接種，并且將接種濃度用標(biāo)簽紙?jiān)谂囵B(yǎng)皿上做好記錄。實(shí)驗(yàn)完成后，整理并關(guān)閉超凈工作臺(tái)，把已接種好的培養(yǎng)基放入25℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6-7d。直到有菌落形成時(shí)，就可以對(duì)菌株進(jìn)行純化處理。

2.3.3 菌株純化

（1）準(zhǔn)備工作：培養(yǎng)至第6d，已經(jīng)在培養(yǎng)基上可以明顯觀察到菌落。挑選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛的菌落，使用涂布平板劃線法進(jìn)行進(jìn)一步的純化處理。

（2）平板劃線法純化菌種：在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行劃線操作：首先在培養(yǎng)皿的底部用記號(hào)筆畫出五個(gè)區(qū)域，并標(biāo)號(hào)。涂布劃線時(shí)注意在酒精燈周圍操作，先把接種環(huán)在酒精燈上灼燒2、3秒，等待接種環(huán)的溫度降低，可以把接種環(huán)放入培養(yǎng)基中等待降溫，防止較高的溫度殺死菌種。接著用接種環(huán)沾取菌，從標(biāo)記的第I個(gè)區(qū)域開始劃線，畫出3、4條線后，用一定的角度連接著第Ⅰ個(gè)區(qū)域，繼續(xù)朝第Ⅱ個(gè)區(qū)域劃出3-4條線，接著再朝第三個(gè)區(qū)域畫線，以此類推。

2.3.4 菌株鑒定

在本試驗(yàn)中對(duì)于菌株的檢測(cè)主要采用傳統(tǒng)的生物形態(tài)學(xué)鑒定法和ITS序列鑒定法。

（1）形態(tài)學(xué)鑒定的方法：

利用電子顯微鏡對(duì)菌種進(jìn)行觀察并記錄菌種的相關(guān)特征，初步判斷該菌種的種類。被純化的菌種檢測(cè)出有25個(gè)孢子囊、分生孢子及厚垣孢子，根據(jù)記錄的優(yōu)勢(shì)菌種形態(tài)特征，先對(duì)比、分析出一類屬種。

生長(zhǎng)速率的測(cè)定：在無(wú)菌環(huán)境下，把優(yōu)勢(shì)菌株打成直徑為5 mm的菌餅，轉(zhuǎn)移至條件為25℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7 d后，量取優(yōu)勢(shì)菌的直徑并再次記錄優(yōu)勢(shì)菌的特征。

（2）分子鑒定的方法：

①DNA的提取

利用優(yōu)勢(shì)種的菌絲，分步進(jìn)行操作：a.研磨菌絲，加進(jìn)500 μL裂解液，放置10 min；b.加入濃度是3M的KAC 150 μ L，經(jīng)離心（12000 rpm）15 min，取其上清；c.重復(fù)b，取上清液加入異丙醇，在12000 rpm條件下離心至15 min；d.取上清，加300 μL 70%的乙醇沉淀DNA，12000 rpm離心10 min，洗滌 4次；e.等水分散失，加 0.1×TE 30 μL，最終獲取液體狀態(tài)下的DNA。

②PCR擴(kuò)增

引物是通用引物ITS4（5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3'，擴(kuò)增體系的總體積是 25μL（DNA模板 1μL、10× buffer的緩沖液體 2.5μL、dNTPs 2μL、正引物1μL的體積、反向引物 1μL。Ex Taq DNA 聚合酶 0.125μL和ddH2O 17.4 μL），把體系中的不加菌株DNA提取物作為陰性對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增完成取出產(chǎn)物保存在4度冰箱，備用。

③電泳

a.制膠：稱 0.2 g瓊脂糖，加 20 mL的 0.5×TBE緩沖液（pH8.0），用微波爐加熱1.5 min，拿出瓊脂糖溶液，靜置一段時(shí)間，加1 μL Goldview指示劑，搖勻；插好梳子，穩(wěn)定模具，把凝膠倒入制膠模具。

b.電泳：將制膠板置于電泳槽中。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入2.5 μL溴酚藍(lán)，混勻后點(diǎn)樣。開啟設(shè)備，設(shè)定電壓（120 V）和時(shí)間（30 min）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中查看拍照并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送到華大基因生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

④序列分析

把測(cè)序所得序列放到National Center for Biotechnology Information（NCBI）核酸數(shù)據(jù)庫(kù)Blast檢測(cè)，然后下載相應(yīng)菌株序列。把所有菌株序列導(dǎo)入MEGA6.0軟件用多序列比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，肯定菌株種別。

2.4 數(shù)據(jù)分析

PCR產(chǎn)物測(cè)序后提交到GenBank中，經(jīng)BLAST比對(duì)。

3 結(jié)果與分析

3.1 優(yōu)勢(shì)菌株的分離、純化

以優(yōu)質(zhì)土壤為材料，利用稀釋涂布分離得到5種菌；進(jìn)一步利用平板劃線純化該菌株，最終得到優(yōu)勢(shì)菌株S3（詳見圖1），該菌株在25℃，PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)旺盛，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)。

3.2 目標(biāo)菌株的鑒定

3.2.1 形態(tài)鑒定

利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的方法，對(duì)3.1分離、純化得到的菌株S3進(jìn)行觀察：利用電子顯微鏡觀察，優(yōu)勢(shì)菌種S3邊緣薄，中心有不規(guī)則狀的條紋，向上突起的菌絲在球形頂囊上分生出粗糙的孢子梗，孢子梗中長(zhǎng)出許多分生孢子，具有足細(xì)胞。呈橄欖色，放射圓柱狀1-2節(jié)球狀，菌落大小4-8.5nm。根據(jù)菌株S3的菌落和孢子形態(tài)等特征，初步推斷該菌屬為青霉屬菌株（詳見圖 2）。

3.5.2 分子鑒定

提取菌株變幻青霉DNA，進(jìn)行凝膠電泳及PCR擴(kuò)增得到1條946 bp的清晰條帶（圖3），將此PCR產(chǎn)物測(cè)序后提交到GenBank中，經(jīng)BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，病原真菌的rDNA-ITS序列與Penicillium Variabile（HM469398）的序列相似度高達(dá)100%。依據(jù)比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），表明該菌應(yīng)歸為Penicillium Variabile。

結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定，確定從茶園土壤中分離純化出的菌為變幻青霉。

圖1 利用平板劃線純化出的優(yōu)勢(shì)菌S3

圖2 S3形態(tài)特征

圖3 S3 ITS擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖4 S3的系統(tǒng)發(fā)育樹

4 結(jié)論與討論

4.1 討論

不同海拔、土壤、品種、樹齡、季節(jié)及管理方式，茶園土壤的優(yōu)勢(shì)菌株各異，且隨著土層的加深，真菌的種類和數(shù)量均逐漸減少；在茶園16目29屬39種微生物中，霉菌的種類最多[18-19]。本實(shí)驗(yàn)取黔南州茶園優(yōu)質(zhì)土壤為材料，并對(duì)其進(jìn)行稀釋分離，將其樣品懸液涂布于培養(yǎng)皿培養(yǎng)得出多種菌種，又對(duì)菌種進(jìn)行分離，再挑取菌種純化得到優(yōu)勢(shì)菌株S3。

為了明白優(yōu)勢(shì)菌株的背景，對(duì)于優(yōu)勢(shì)菌株S3的鑒定首要采取傳統(tǒng)的生物形態(tài)學(xué)鑒定法，利用電子顯微鏡觀察，初步推測(cè)該優(yōu)勢(shì)菌株S3為青霉屬菌株。青霉屬、曲霉屬和藍(lán)狀菌屬微生物均是土壤重要的腐生真菌，在不同地區(qū)和不同土壤類型都有廣泛分布，特別是熱帶或亞熱帶的磚紅壤、赤紅壤、紅壤、黃壤和燥紅土等酸性土壤[20]。為了研究?jī)?yōu)勢(shì)菌株的背景、便于進(jìn)一步開發(fā)該菌株，需進(jìn)一步明確目標(biāo)菌的種屬關(guān)系。經(jīng)過(guò)ITS序列分析，優(yōu)勢(shì)菌株S3與Penicillium Variabile（HM469398）的序列相似度高達(dá)100%。依據(jù)比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)合形態(tài)鑒定表明該菌應(yīng)歸為變幻青霉Penicillium Variabile；該菌株在蘆葦根際土壤、山西歷山自然保護(hù)區(qū)土壤等[21-22]中均有發(fā)現(xiàn)，而在茶園土壤中為首次報(bào)道。

4.2 結(jié)論

本研究從優(yōu)質(zhì)土壤中稀釋培養(yǎng)出菌種，并通過(guò)分離、純化得到優(yōu)勢(shì)菌株S3；結(jié)合形態(tài)鑒定和分子鑒定可確定本次研究所得到的優(yōu)勢(shì)菌株S3為變幻青霉。

5 展望

目前，化學(xué)肥料的使用已經(jīng)有不同的危害，微生物是土壤的重要組成部分，在土壤中有至關(guān)重要的作用；利用有益微生物參與有機(jī)肥的配制，可調(diào)節(jié)速效與緩效養(yǎng)分、提高肥料利用率，減輕氮肥造成的硝酸鹽積累以及磷鉀肥造成的重金屬污染。但用變幻青霉作為生物有機(jī)肥的報(bào)道很少，對(duì)其是否有益于茶園土壤改善還有待于進(jìn)一步研究。