妊娠對(duì)肺動(dòng)脈高壓肺循環(huán)影響的實(shí)驗(yàn)研究

李 月 金 沐 景 赫 孫雨薇 程衛(wèi)平

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是指靜息狀態(tài)下經(jīng)肺動(dòng)脈導(dǎo)管測(cè)量平均肺動(dòng)脈壓≥25mmHg(1mmHg=0.133kPa)的病理狀態(tài)[1]。妊娠因其血流動(dòng)力學(xué)變化加重心肺循環(huán)負(fù)擔(dān)，可以導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓[2]，被認(rèn)為是PAH禁忌[3-4]。我們前期發(fā)現(xiàn)，妊娠合并肺動(dòng)脈高壓患者中96.7%的患者合并有先心病[5]，而國(guó)外報(bào)道中，64%為合并特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓(idiopathic PAH，IPAH)[6]。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論類型是否相同，大多數(shù)產(chǎn)婦死亡事件都發(fā)生在分娩后的第一個(gè)月內(nèi)[12]。為此，建立妊娠合并肺動(dòng)脈高壓的動(dòng)物模型、探尋產(chǎn)后PAH患者死亡的原因，具有明顯臨床意義和研究?jī)r(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)計(jì)劃在MCT誘導(dǎo)PAH大鼠模型的基礎(chǔ)上建立妊娠合并PAH大鼠模型。并通過(guò)此模型，觀察妊娠對(duì)PAH大鼠肺循環(huán)的影響，探索影響終止妊娠后PAH產(chǎn)婦發(fā)生嚴(yán)重心臟不良事件的原因。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 本實(shí)驗(yàn)使用雌性,SD大鼠，依照首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)與使用指南，飼養(yǎng)于北京安貞醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心(SYXK(京)2016-0027)。所有大鼠提供充足的食物和水源，飼養(yǎng)環(huán)境為24h的亮暗光照循環(huán)，空氣濕度50%～60%，溫度20～22oC。

將大鼠隨機(jī)分為四組：①空白對(duì)照組(n=15)，②野百合堿(MCT)組(n=20)，③妊娠組(n=16)，④妊娠MCT組(n=20)。四組大鼠均每周稱重1次，稱重同時(shí)按“活躍”、“一般”及“不活躍”記錄一般狀態(tài)。

2.肺高壓模型的建立 經(jīng)過(guò)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)之后(即7周齡)，MCT及妊娠MCT組大鼠通過(guò)頸背部單次皮下注射配制好的MCT(Sigma-Aldrich, 美國(guó)；劑量：60 mg/kg)的方法來(lái)誘導(dǎo)PAH。對(duì)照組及妊娠組給予相同容量的0.9%氯化鈉溶液。

3.妊娠模型的建立 在大鼠9周齡時(shí)，妊娠及妊娠合MCT組大鼠開(kāi)始進(jìn)行合籠(雌雄共養(yǎng))。按照雄∶雌=1∶2～3的比例進(jìn)行合籠，時(shí)間從每天20:00到次日8:00。每天早上結(jié)束合籠時(shí)檢查雌鼠的陰栓，若可見(jiàn)陰栓即認(rèn)為合籠成功，否則繼續(xù)合籠。為控制合籠成功時(shí)間差距過(guò)大導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差，將合籠不成功大鼠繼續(xù)合籠時(shí)長(zhǎng)限制在1周之內(nèi)。

4.血流動(dòng)力學(xué)測(cè)量 在記錄成功合籠時(shí)間的18d后，即達(dá)到大鼠的妊娠晚期，進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測(cè)量。合籠前對(duì)照組及MCT組中體重(相差≤5g)及一般狀態(tài)與妊娠組及妊娠MCT組相近的大鼠，在同一天采集指標(biāo)。首先使用3%戊巴比妥鈉(2～3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，按7mL/kg的潮氣量，50次/min的呼吸頻率，和2.5cmH2O(1 cmH2O=0.098kPa)的呼末壓力進(jìn)行機(jī)械通氣[18](呼吸機(jī)：奧爾科特ALC-V8，上海)。經(jīng)右側(cè)股動(dòng)脈置管(BD Insyte-W 24G, 美國(guó))實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)體循環(huán)壓力(SAP)變化；開(kāi)胸后經(jīng)右心室置管于肺動(dòng)脈主干，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)肺動(dòng)脈壓力(PAP)變化(壓力換能器：Edwards PX260，美國(guó)；監(jiān)護(hù)儀：Hewlett M1 166A，美國(guó))。

5.肺動(dòng)脈形態(tài)學(xué)測(cè)量 結(jié)束血流動(dòng)力學(xué)測(cè)量后，麻醉狀態(tài)下處死大鼠。留取大鼠右肺中下葉固定于4%多聚甲醛溶液，經(jīng)石蠟包埋及HE染色(染色液：中杉金橋ZLI-9615，北京)，制成5μm厚切片。每只大鼠光鏡(尼康Eclipse 90i, 日本)下觀察10～12個(gè)直徑50～200mm的肺中小動(dòng)脈，通過(guò)計(jì)算相對(duì)中膜厚度評(píng)估肺血管重塑程度(照相：尼康DS-Ri1-U3，日本；測(cè)量：Image Pro Plus 6.0, 美國(guó))。相對(duì)中膜厚度由以下公式求得：(ED-ID)/ED x 100% (ED, 外徑; ID, 內(nèi)徑)[19]。另外統(tǒng)計(jì)平均每只大鼠10個(gè)低倍鏡視野下的肺血管密度(個(gè)/mm2)，并分別統(tǒng)計(jì)增厚肺小血管密度，非增厚肺小血管密度及阻塞肺小血管密度。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過(guò)SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析。經(jīng)正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)后，符合正態(tài)分布及方差齊的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表達(dá), 采用方差分析，兩兩比較采用SNK 法檢驗(yàn); 不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表達(dá)，采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)(率)表示,采用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

在注射MCT后、進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)測(cè)量前，MCT組共死亡8只大鼠，妊娠MCT組共死亡6只大鼠。而妊娠組有4只未合籠成功，妊娠MCT組未死亡大鼠中有2只未合籠成功。最終，各組大鼠例數(shù)分別為：①空白對(duì)照組(n=15)，②MCT組(n=12)，③妊娠組(n=12)，④妊娠MCT組(n=12)。

1.MCT增加大鼠肺循環(huán)壓力 空白對(duì)照組與MCT組PAP比較 [(19.33±5.39)vs. (33.5±5.49)mmHg，P<0.001]顯著降低，PAP/SAP[37.31(27.73，42.71)vs.77.82(53.33，100)%，P<0.001]也呈同一趨勢(shì), SAP [(53.93±10.91)vs. (44.17±16.75)mmHg，P=0.079] 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與妊娠組PAP [(19.33±5.39)vs.(19.42±2.61)mmHg]；PAP/SAP [37.31(27.73，42.71)vs. 34.59(33.33，36.96)%]，及SAP比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與妊娠MCT組 PAP[(19.33±5.39)vs.(26.25±5.53)mmHg,P=0.001]及PAP/SAP比較[37.31(27.73，42.71)vs.54.65(36.84，71.11)%，P=0.013]均顯著降低; SAP [(55.75±11.30)vs. (50.83±18.32)mmHg，P=0.435] 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

圖1 各組大鼠PAP及SAP水平注：與空白對(duì)照組相比，aP<0.001；妊娠MCT組vs.妊娠組，bP<0.01；MCT組vs.妊 娠MCT組，bP<0.01

2. MCT損傷大鼠肺血管基本形態(tài) (1)與空白對(duì)照組及妊娠組對(duì)比，MCT組及妊娠MCT組大鼠的肺組織切片顯示，肺小動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增生，可見(jiàn)微血管瘤形成及小血管阻塞。光鏡下可見(jiàn)此兩組大鼠的肺動(dòng)脈管壁平滑肌層明顯增厚，管腔縮小(圖2)。

(2)大鼠肺小動(dòng)脈相對(duì)中膜厚度 四組大鼠相對(duì)中膜厚度的比較可見(jiàn): MCT組大鼠較空白對(duì)照組 [(38.00±11.56)vs. (23.87±3.78)%，P<0.001] 相對(duì)中膜厚度明顯增厚; 妊娠MCT組大鼠較妊娠組 [(34.83±6.37)vs. (29.08±4.66)%，P=0.019] 相對(duì)中膜厚度明顯增厚(圖3)。

(3)大鼠的肺小動(dòng)脈密度 各組大鼠的肺小動(dòng)脈密度分析結(jié)果顯示:MCT組及妊娠MCT組大鼠總肺小動(dòng)脈密度、增厚肺小動(dòng)脈密度及閉塞肺小動(dòng)脈密度的增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而未增厚肺小動(dòng)脈密度明顯小于其他兩組 (P<0.05,表1)。四組不同程度中膜厚度肺小動(dòng)脈數(shù)量占總肺小動(dòng)脈數(shù)量的比例的結(jié)果, 進(jìn)一步驗(yàn)證了表1結(jié)論。MCT組及妊娠MCT組大鼠增厚及閉塞肺小動(dòng)脈密度的比例也明顯高于另外兩組(表2)。

表1 各組大鼠肺小動(dòng)脈密度 個(gè)/mm2)

注：MCT組與對(duì)照組比較,aP<0.001，P<0.05; 妊娠MCT組與妊娠組比較，aP<0.001；妊娠MCT組與MCT組比較，bP<0.01

圖3 四組間肺小動(dòng)脈相對(duì)中膜厚度對(duì)比注:與空白對(duì)照組比較，aP<0.001, bP<0.01；與妊娠組比較，cP<0.05

組別未增厚肺小動(dòng)脈比增厚肺小動(dòng)脈比閉塞肺小動(dòng)脈比空白對(duì)照組(n=15)96.92.630.5MCT組(n=12)34.3a33.732.1妊娠組(n=12)94.94.710.4妊娠MCT 組(n=12)24.3a46.828.9

注:對(duì)照組與MCT組比較,aP<0.001; 妊娠MCT組與妊娠組比較，aP<0.001

3.妊娠對(duì)大鼠肺循環(huán)呈雙向影響 血流動(dòng)力學(xué)方面，妊娠MCT組較MCT組大鼠[(26.25±5.53)vs.(33.5±5.49)mmHg，P=0.004] PAP的降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。肺動(dòng)脈形態(tài)方面，妊娠MCT組較MCT組大鼠[ (3.55±0.81)vs. (2.27±0.84)個(gè)/mm2，P=0.001]有更多增厚的肺小動(dòng)脈(表1)；妊娠組較空白對(duì)照組大鼠[(29.08±4.66)vs.(23.87±3.78)%，P=0.004]相對(duì)具有更厚的肺小動(dòng)脈中膜(圖3)。

討 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MCT能夠顯著增加肺循環(huán)的壓力，從血流動(dòng)力學(xué)方面驗(yàn)證了PAH模型的成功建立。肺動(dòng)脈高壓患者診斷的金標(biāo)準(zhǔn)就是PAP的升高，本實(shí)驗(yàn)所有經(jīng)MCT誘導(dǎo)的大鼠其PAP的增高都具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，已足夠確定PAH模型的建立。而臨床醫(yī)生考量PAH患者病情的危重程度則要綜合PAP及SAP的水平，所以經(jīng)MCT誘導(dǎo)大鼠具有更高的PAP/SAP水平也更加驗(yàn)證了這一模型建立成功的可信度。

MCT損傷大鼠肺血管基本形態(tài)則從病理學(xué)角度驗(yàn)證了PAH模型的成功建立。氧化應(yīng)激、肺循環(huán)內(nèi)膜功能障礙及血管重塑都是導(dǎo)致PAH的重要原因[1]。MCT通過(guò)肺血管內(nèi)膜功能障礙及血管重塑來(lái)破壞肺血管結(jié)構(gòu)[20]，進(jìn)而導(dǎo)致肺血管收縮、增殖及阻塞性改變，從而誘發(fā)肺血管阻力升高，這是其誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓模型的機(jī)理[21]。肺血管高阻力限制了肺動(dòng)脈血流，增加了肺主動(dòng)脈及右心負(fù)荷，進(jìn)而導(dǎo)致肺動(dòng)脈及右心室壓力升高[22]。本實(shí)驗(yàn)病理組織檢查中，顯著的肺血管增生增殖及阻塞性改變都得以復(fù)制，包括相對(duì)中膜厚度增厚、肺小動(dòng)脈數(shù)量增多及出現(xiàn)閉塞小動(dòng)脈。進(jìn)一步驗(yàn)證了PAH大鼠模型建立的成功。

在進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)測(cè)量時(shí)(即合籠成功18d后)，已處于妊娠大鼠的孕晚期，此時(shí)增大的子宮可通過(guò)直視觀察到，從而確定妊娠模型的成功。通過(guò)以上方法，確定了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中所統(tǒng)計(jì)妊娠組及妊娠MCT組大鼠符合預(yù)期研究模型的質(zhì)量要求。

除以上結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)還顯示了妊娠因素對(duì)大鼠肺循環(huán)的特殊影響。首先，PAP及PAP/SAP的水平在妊娠MCT組明顯低于MCT組大鼠，這說(shuō)明妊娠過(guò)程對(duì)PAH存在保護(hù)性作用。但來(lái)自這兩組大鼠的增厚肺小動(dòng)脈數(shù)量，則在妊娠組增長(zhǎng)的更為顯著，這顯示妊娠同樣也能加重肺血管結(jié)構(gòu)的破壞。另兩組之間，妊娠組比空白對(duì)照組具有更厚的肺小動(dòng)脈相對(duì)中膜厚度，也進(jìn)一步驗(yàn)證了妊娠對(duì)肺血管結(jié)構(gòu)帶來(lái)的不良影響。這兩個(gè)看似互相矛盾的結(jié)果，提示了妊娠對(duì)肺循環(huán)的影響可能存在更復(fù)雜的機(jī)制，妊娠期間可能同時(shí)存在保護(hù)肺循環(huán)與損傷肺血管的因子。下面是有關(guān)這一設(shè)想的一些證據(jù)。

大量臨床資料統(tǒng)計(jì)顯示，妊娠合并PAH患者的死亡事件多發(fā)生于終止妊娠之后。分娩后的第一周內(nèi)被認(rèn)為是臨床上最危險(xiǎn)的時(shí)間段[7]。分娩致使回心血量劇增極易導(dǎo)致此類患者發(fā)生心力衰竭，這已成為妊娠合并PAH產(chǎn)后死亡的首要原因[8-11]。其它重要的死因還包括妊娠高凝狀態(tài)導(dǎo)致的肺栓塞及腦栓塞等。這些伴隨妊娠的特殊病生理狀態(tài)需要在終止妊娠6-8周后基本恢復(fù)到正常水平[23]。但是在這些統(tǒng)計(jì)資料中，還存在大于終止妊娠后8周甚至是終止妊娠半年后的遠(yuǎn)期死亡事件。所以，我們推測(cè)還存在某些與妊娠相關(guān)的因素，能夠?qū)Ψ窝h(huán)造成影響，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)損傷性改變，由于其不可逆性，或許與終止妊娠后稍晚期肺動(dòng)脈高壓的死亡情況相關(guān)。

由于IPAH具有顯著的年輕育齡女性高發(fā)傾向，許多研究開(kāi)始關(guān)注性激素與PAH之間的關(guān)系[2, 24-26]。這一流行病學(xué)特征，顯示出雌性激素具有加重PAH的影響。但另一項(xiàng)發(fā)現(xiàn)卻與之相悖，即一旦患上PAH，女性患者通常比男性患者具有更輕的病情及更好的預(yù)后[27]。提示，雌性激素可能對(duì)PAH患者病情具有雙向的影響。同時(shí)，雌性激素作為孕期顯著增長(zhǎng)的特征性激素，是妊娠期間最具代表性的特殊血清學(xué)成分之一。那么，妊娠后雌性激素水平變化，很可能就是實(shí)驗(yàn)中所觀察到對(duì)肺循環(huán)具有雙向作用的因子。

大量研究證明，女性特征性的雌激素及孕激素都具有明顯擴(kuò)張肺血管的作用[12]，這似乎可以解釋女性PAH患者較男性病情輕的特點(diǎn)。或許與性激素對(duì)PAH肺循環(huán)的保護(hù)性作用有關(guān)。目前，對(duì)性激素加重PAH病情的確切機(jī)制尚無(wú)定論。大多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將焦點(diǎn)放在對(duì)雌激素的主要活性成分雌二醇(17β-estradiol，E2)的研究上。一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，E2能促進(jìn)肺血管的增殖，并且有促有絲分裂、促血管增生以及抗凋亡的作用，從而加重對(duì)肺血管的破壞，給肺循環(huán)帶來(lái)的不利影響[26, 28]。低氧、炎癥及某些藥物的影響下，E2對(duì)肺循環(huán)的破壞性作用更會(huì)加重。所以，雌激素或許就是我們所猜想的這一重要因子。

目前，關(guān)于雌激素與PAH的研究很多，但不同的動(dòng)物模型以及不同劑量的外源性雌激素，導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)的結(jié)果很不一致。值得注意的是，目前尚未出現(xiàn)任何一項(xiàng)直接在妊娠合并PAH大鼠模型上進(jìn)行的相關(guān)研究。這為接下來(lái)的研究提供了方向。

綜上所述, 本實(shí)驗(yàn)成功建立了妊娠合并PAH大鼠模型。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)了妊娠對(duì)于PAH大鼠肺循環(huán)的雙重影響。雌激素很可能是雙重影響的主要介導(dǎo)者，在PAH患者妊娠期間，雌激素在擴(kuò)張肺血管的同時(shí)，也加重了肺小動(dòng)脈不可逆的組織學(xué)損傷。以上改變可能是妊娠對(duì)PAH肺循環(huán)雙向影響的重要機(jī)制之一。