辣椒菌核病菌毒素的產(chǎn)生及其生物活性測定

于舒怡 劉志恒 邵丹 劉長遠(yuǎn)

摘要：采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)和室內(nèi)接種試驗(yàn)，開展辣椒菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）毒素的時間序列分析及其生物活性測定。結(jié)果表明，辣椒菌核病菌分泌的毒素產(chǎn)物為草酸，隨著菌絲的不斷生長，病菌分泌的草酸濃度逐漸上升，當(dāng)病菌生長速度最快時，草酸含量也達(dá)到最大值，pH則相應(yīng)降低到最小值。草酸毒素可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基質(zhì)的pH。草酸毒素和菌絲的共同作用才能有效侵染寄主組織，且草酸毒素對辣椒種子的萌發(fā)活力、幼苗的生長和植株的發(fā)育均有較強(qiáng)的抑制作用。

關(guān)鍵詞：辣椒菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）；草酸毒素；生物活性

中圖分類號：S432.4；S436.418 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）14-0053-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.14.012 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： The time series analysis and biological activity of toxin of Sclerotinia sclerotiorum were carried out by artificial culture and inoculation test. The results showed that the main toxin product produced by S. sclerotiorum was oxalic acid，and the concentration of oxalic acid increased gradually with the mycelium growth. When the growth rate of pathogen was the fastest，the content of oxalate reached the maximum value，and the pH correspondingly decreased to a minimum. Oxalate could regulate the pH of the culture matrix. The combined action of oxalic acid and mycelium could effectively infect host tissues，and oxalate toxin had a strong inhibitory effect on seed germination vigor，seedling growth and plant development of pepper.

Key words： Sclerotinia sclerotiorum； toxalic acid toxin； biological activity

辣椒菌核?。⊿clerotinia rot of pepper）是由子囊菌門核盤菌屬核盤菌[Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary]侵染引起的一種真菌病害[1]。隨著設(shè)施辣椒種植面積逐年擴(kuò)大和連茬種植，辣椒菌核病發(fā)生和危害日趨嚴(yán)重，已成為遼寧辣椒生產(chǎn)的主要病害之一[2，3]。辣椒菌核病菌分泌的草酸產(chǎn)物是其產(chǎn)生致病性的基本決定因子[4，5]。草酸可破壞植物細(xì)胞壁的完整性，促進(jìn)細(xì)胞溶解酶的活性，通過酸化寄主組織誘導(dǎo)植株萎蔫，使寄主組織液外滲，利于病菌的侵入和擴(kuò)展[6]。前人在油菜、大豆、向日葵等作物上對草酸毒素產(chǎn)生的培養(yǎng)條件[6，7]、致病性[8]、致病機(jī)制[9]、寄主的抗病機(jī)制[10]等方面均有深入的研究。然而，目前尚未見有關(guān)辣椒菌核病菌毒素產(chǎn)毒條件及生物測定方法的報道。因此，本研究采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)和室內(nèi)接種試驗(yàn)，開展辣椒菌核病菌毒素的時間序列分析及其生物活性測定，為選育抗病品種、有效控制辣椒菌核病提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株采自遼寧省朝陽北票市蒙古營鄉(xiāng)躍進(jìn)示范園試驗(yàn)田，經(jīng)組織分離法分離純化獲得純凈的核盤菌菌絲，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 產(chǎn)毒培養(yǎng)液

選擇馬鈴薯葡萄糖（PD）培養(yǎng)液進(jìn)行毒素培養(yǎng)。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，去離子水1 000 mL，121 ℃高溫濕熱滅菌30 min后備用。

1.3 病菌產(chǎn)生的時間序列分析

將菌核在PDA平板上培養(yǎng)3 d，待長出新鮮菌絲時，取一片直徑6.5 mm菌餅移入裝有60 mL PD培養(yǎng)液的150 mL三角瓶中，置于搖床中，110 r/min、25 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，以不接菌的PD培養(yǎng)液為對照，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。培養(yǎng)2 d后逐日測定菌絲干重、pH和草酸含量，連續(xù)測定14 d。

1.4 菌絲干重的測量

先將備好的濾紙在80 ℃的恒溫箱中烘至恒重，用電子天平稱得所用每張濾紙的重量，再用雙層濾紙過濾病原菌的培養(yǎng)液，將過濾后的濾紙及其上面的菌絲體在80 ℃的恒溫箱中烘干至恒重，然后用電子天平稱取其重量，這兩次稱量數(shù)據(jù)的差值即為菌絲干重。

1.5 毒素pH的測定

采用METTLER TOLEDO（Five Easy）pH計進(jìn)行毒素pH的測量。

1.6 草酸毒素含量的測定

將毒素用去離子水定容到60 mL，取30 mL于三角瓶中，加入25% CaCl2 2 mL，并加熱5 min，然后放置過夜，充分沉淀，離心（3 000 r/min，10 min），棄去上清液，用去離子水洗滌沉淀3次，將沉淀溶于5 mL H2SO4中（水∶硫酸=9∶1），充分溶解后，移入滴定瓶中，并用20 mL去離子水洗滌溶液，在溶液中加入1 mL 10% MnSO4溶液，加熱到60～70 ℃，用1.58 g/L KMnO4滴定至顯玫瑰色，且30 s不退色，計算草酸含量。1 mL 1.58 g/L KMnO4相當(dāng)于0.145 mg草酸（H2C2O4）。3次重復(fù)的平均值為培養(yǎng)液草酸濃度。

1.7 病菌毒素生物活性測定

產(chǎn)毒培養(yǎng)條件同“1.3”，培養(yǎng)7 d后，分別采用雙層紗布和細(xì)菌過濾器過濾，將辣椒菌核病菌培養(yǎng)濾液平均分為兩份，一份于121 ℃高溫蒸汽滅菌30 min，離心取上清液為毒素粗提液；另一份為菌核病菌培養(yǎng)液。

用辣椒葉片、幼苗、種子進(jìn)行毒素的生物活性測定。①用毒素粗提液200 μL分別直接接種、針刺接種和脫脂棉包葉柄處理成株期辣椒葉片，并保濕處理，每個處理20片離體葉片，以無菌的產(chǎn)毒培養(yǎng)液為對照，3 d后觀察處理的癥狀表現(xiàn)。②用病菌培養(yǎng)液和毒素粗提液分別處理辣椒幼苗，各使用20 mL和10 mL兩個梯度，每個處理20株，以無菌的產(chǎn)毒培養(yǎng)液為對照，7 d后觀察其癥狀表現(xiàn)。③用病菌培養(yǎng)液和毒素粗提液各20 mL浸泡辣椒種子，每個處理100粒種子，以無菌的產(chǎn)毒培養(yǎng)液為對照，進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，計算各處理種子的萌發(fā)率及胚根平均長度。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行測量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病菌產(chǎn)生的時間序列分析

辣椒菌核病菌在毒素培養(yǎng)液中培養(yǎng)1～12 d，每天測定菌絲生長量、草酸含量及pH的變化。結(jié)果表明，辣椒菌核病菌在生長過程中菌絲干重增長迅速，與時間呈正比，并呈“S”型曲線增加，培養(yǎng)1 d后，病菌即開始生長，6～10 d生長速度最快，第十天其菌絲生長量達(dá)到最大值，隨之，增殖速度逐漸降低（圖1a）。培養(yǎng)1 d后毒素的pH開始下降，9 d后呈現(xiàn)上升的趨勢（圖1b）。圖1c顯示，培養(yǎng)1 d后，草酸毒素開始積累，6～9 d草酸含量變化速度最快，第九天草酸含量達(dá)到最高峰，隨后其含量略有下降，其中的原因未明。綜合分析表明，隨著病菌的不斷生長，病菌分泌的毒素濃度逐漸上升，當(dāng)病菌生長速度最快時，草酸含量也達(dá)到最大值，pH則相應(yīng)降低到最小值；隨著營養(yǎng)成分的不斷利用，病菌生長速度減慢，草酸的積累逐步減少，pH也相應(yīng)略有回升。

2.2 病菌毒素的生物活性測定

2.2.1 毒素對辣椒成株期葉片生物活性測定 毒素粗提液接種辣椒葉片，處理方法不同，癥狀差異明顯。直接接種處理的葉片無明顯癥狀；經(jīng)針刺處理的葉片，在侵染點(diǎn)周圍出現(xiàn)水漬狀斑點(diǎn)，病斑中間進(jìn)一步變?yōu)辄S褐色，7 d后葉片腐爛；使用脫脂棉包裹葉柄的處理，癥狀最為明顯，葉片逐漸退綠，3 d即可腐爛（圖2）。

由試驗(yàn)結(jié)果分析，辣椒菌核病毒素只有與菌絲共同作用才能侵染成功，在無病原菌菌絲的情況下，不能侵染寄主組織；在組織受傷的情況下，毒素可以使葉片組織退綠、萎蔫、腐爛；同時，毒素經(jīng)葉脈擴(kuò)散較快，通過導(dǎo)管傳輸。

2.2.2 毒素對辣椒幼苗的生物活性測定 用辣椒菌核病菌培養(yǎng)液和毒素粗提液處理幼苗，葉片退綠，幼苗出現(xiàn)萎蔫、生長緩慢、落葉等病狀，植株生活力減弱（圖3）。其中，20 mL病菌培養(yǎng)液處理的植株，根系組織壞死，莖部有水漬狀病斑，并不斷擴(kuò)展，7 d后死亡；毒素粗提液對植株的致萎作用較病菌培養(yǎng)液弱，植株葉片略黃，有落葉現(xiàn)象。

2.2.3 毒素對辣椒種子生物活性的測定 用辣椒菌核病菌培養(yǎng)液和毒素粗提液處理辣椒種子，辣椒種子萌發(fā)率極低，分別為18.00%和22.50%，與對照相比，差異極顯著（表1）。第九天胚根平均長度分別為35.60和31.30 mm，且根尖變黃；對照培養(yǎng)處理的種子，其萌發(fā)率為92.33%，胚根生長正常，生命力旺盛（圖4）。

3 小結(jié)與討論

人工培養(yǎng)條件下，隨著辣椒菌核病菌的不斷生長，病菌分泌的毒素濃度逐漸上升，當(dāng)病菌生長速度最快時，草酸含量也達(dá)到最大值，pH則相應(yīng)降低到最小值；隨著營養(yǎng)成分的不斷利用，病菌生長速度減慢，草酸的積累逐步減少，pH也相應(yīng)略有回升，表明作為酸性物質(zhì)的草酸成分，對培養(yǎng)基質(zhì)的pH有調(diào)節(jié)作用。

有學(xué)者認(rèn)為草酸毒素可使向日葵葉片的細(xì)胞膜透性逐漸增大，造成電解質(zhì)外滲，即草酸毒素對向日葵葉片細(xì)胞具有一定的破壞作用[11]。然而，本研究結(jié)果表明，辣椒菌核病毒素必須在有自然傷口或菌核病菌菌絲侵染形成病斑的條件下才能侵染寄主組織，而在健康寄主上直接接種草酸毒素則無法侵染，說明核盤菌在侵染不同寄主作物上的致病力存在一定差異，草酸毒素可以加速受病組織迅速分解、破壞，甚至造成組織腐爛；同時，毒素經(jīng)葉脈擴(kuò)散較快，通過導(dǎo)管傳輸，因此病菌在田間危害時，常會在短時間內(nèi)導(dǎo)致寄主組織的破壞和腐解。

辣椒菌核病菌培養(yǎng)液和毒素粗提液對辣椒葉片、幼苗以及種子均有一定的抑制作用。草酸毒素可使葉片退綠，幼苗出現(xiàn)萎蔫、生長緩慢、落葉、植株生活力減弱，辣椒種子萌發(fā)率極低、胚根長度較短、且根尖變黃、生命力差。說明草酸對辣椒種子的萌發(fā)活力、幼苗的生長和植株的發(fā)育均有較大影響。通過對辣椒菌核病菌草酸毒素進(jìn)行生物活性測定，為今后用草酸接種鑒定辣椒品種對菌核病的抗性研究提供理論依據(jù)。

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