冷凍切片常見問題的探討及應(yīng)對措施

鄭建華 鄒澤陽

【摘 要】目的：探討冷凍切片制作過程中常見問題及應(yīng)對措施，以提高冷凍切片質(zhì)量。方法：規(guī)范各個環(huán)節(jié)，按照組織特點(diǎn)采取相應(yīng)處理方法。結(jié)果：經(jīng)光鏡觀察切片，切片組織切面完整，厚薄均勻，效果良好，所制切片色彩鮮艷，對比清晰。結(jié)論：高質(zhì)量冰凍切片的關(guān)鍵因素是取材、冷凍的溫度和時間、切片的技巧、固定及染色方法。

【關(guān)鍵詞】病理技術(shù)；冷凍切片；常見問題；應(yīng)對措施

【中圖分類號】 R249 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】

A 【文章編號】1005-0019（2018）11-294-01

冰凍切片是一種借助低溫恒冷條件，使新鮮組織迅速冷卻到一定硬度，然后進(jìn)行切片的方法[1]，因其操作快捷、簡便，已常規(guī)應(yīng)用在手術(shù)中快速病理診斷，方便手術(shù)醫(yī)師制定手術(shù)方案。與常規(guī)石蠟切片的診斷相比，局限性和難度更大，因時間受限，組織未經(jīng)固定、脫水等前期處理，細(xì)胞形態(tài)與常規(guī)石蠟切片有著一定的差異，往往易出現(xiàn)冰晶、細(xì)胞腫脹、組織形態(tài)結(jié)構(gòu)不清等現(xiàn)象，直接影響快速病理診斷的及時性及準(zhǔn)確性，從而易出現(xiàn)誤診和漏診，這就要求技術(shù)人員必須制作出高質(zhì)量的切片，滿足診斷要求。筆者經(jīng)過多年的實(shí)踐工作的經(jīng)驗(yàn)積累，根據(jù)我院以婦科腫瘤和乳腺疾患為主的標(biāo)本特色，總結(jié)出了冷凍切片制作過程中常見的一些問題及應(yīng)對措施以提高冷凍切片制作質(zhì)量，現(xiàn)歸納如下。

1 冷凍切片的制作

1.1 取材 由病理醫(yī)師取材，通常選取具有代表性的病變組織1-2塊，如有需要可適量增加取材塊數(shù)。組織的大小應(yīng)適宜，一 般在1.5 cm X1.5 cm×0.3 cm，如有黏液、鈣化及骨組織則先行去除。體積較大的卵巢腫瘤常出現(xiàn)大量壞死，盡可能少取壞死區(qū)，乳腺送檢淋巴結(jié)標(biāo)本應(yīng)盡量剔除脂肪組織。

1.2 速凍 將取材組織放置在滴有包埋劑的冰托上使組織快速冷凍，組織要盡量放平整。切片機(jī)的基礎(chǔ)溫度根據(jù)我科常見冷凍標(biāo)本類型一般置于一20℃，收到標(biāo)本后根據(jù)根據(jù)不同組織進(jìn)行調(diào)整（見表1）。

1.3 切片 將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機(jī)持承器上，啟動粗進(jìn)退鍵，將組織修平。調(diào)好預(yù)切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細(xì)胞密集的薄切，纖維多細(xì)胞稀的稍微厚切，一般在5-10um（見表1）我科通常以5um厚度切片。用毛筆將切片展開，貼附于載玻片上。

1.4 固定 切片后將載玻片及時放人固定液中，以避免細(xì)胞核退變，著色力下降、結(jié)構(gòu)模糊不清等現(xiàn)象的產(chǎn)生[2]。固定液的選擇要根據(jù)冷凍切片的特點(diǎn)，首先要保持組織細(xì)胞原有結(jié)構(gòu)不被破壞，染色鮮艷，結(jié)構(gòu)清晰；其次是滲透力要強(qiáng)而迅速。固定液種類繁多，性能各異，應(yīng)重視固定液的選擇和固定速度。此外組織的固定還與組織成分和醛的濃度、pH值、滲透力、溫度及浸入組織的速度有關(guān)。

1.5 染色 蘇木精染液1 min，稍水洗；0.5%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，稍水洗；1%氨水返藍(lán)數(shù)秒后水洗；0.7%伊紅染液10 s，稍水洗；80%乙醇、 95%乙醇、無水乙醇I、無水乙醇Ⅱ、二甲苯I、Ⅱ各 30s，擦凈標(biāo)本周邊二甲苯后用中性樹膠封固。

1.6 切片質(zhì)量評定標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)鏡下細(xì)胞的收縮程度及切片的染色質(zhì)量進(jìn)行評判[3}（見表2）。

2 冰凍切片常見問題及應(yīng)對措施

2.1 出現(xiàn)冰晶 冰晶是組織在冷凍固化過程中，由于冷凍緩慢，冷凍時間過長，使細(xì)胞質(zhì)和組織間隙內(nèi)未結(jié)合的水逐漸析出形成。應(yīng)對措施：取材大小、厚薄要適宜，過大過厚影響冷凍速度；取材時避免混入水分；冷凍時間要短，只有速凍才能減少組織內(nèi)的冰晶形成，對容易形成冰晶的肌肉、腦組織應(yīng)采用干冰或液氮冷凍，以減少冰晶的形成。[4]

2.2 脫片 偶見于壞死組織或含水量大的組織，如子宮肌瘤黏液變性時。應(yīng)對措施：首先切片前用吸水紙吸去多余水分，切片不能太厚，其次切片固定后用吹風(fēng)機(jī)吹干再染色。

2.3 組織塊脫落 組織塊脫落多因組織與冷凍頭凍結(jié)不緊，稍微受外力的作用便脫落。此外冷凍頭上有用過的包埋劑殘留及修整組織塊時進(jìn)度太大都可導(dǎo)致組織塊從冷凍頭上脫落。應(yīng)對措施策：用過的冷凍頭要及時清洗干凈備用。修整組織時應(yīng)循序漸進(jìn)，不可操之過急。[5]

2.4 切片不全或不能切片 主要原因是組織脂肪及壞死組織過多、冷凍時間過長、冷凍頭溫度不足。應(yīng)對措施：冷凍溫度應(yīng)隨組織塊類型不同進(jìn)行調(diào)節(jié)，組織內(nèi)含過多的脂肪或壞死組織脂肪或壞死組織較一般的組織冷凍的溫度要低些，當(dāng)活組織達(dá)到所需的溫度時，其還比較軟，從而影響切片的完整性和拖延冷凍報告發(fā)出的時間[6]。對于乳腺癌術(shù)中前哨淋巴結(jié)進(jìn)行冷凍前一定要剔除周圍的脂肪組織。冷凍切片時要求凍頭的溫度保持在-25℃～-30℃左右，如溫度過高則會導(dǎo)致切片困難。

2.5 切片皺縮或卷縮 主要常見于切片刀鋒變鈍及防卷板粘有異物，防卷板的作用是防止切片卷縮，但若粘有異物，切片時組織會被擠壓而縮在一起。此外防卷板與刀鋒的位置不協(xié)調(diào)、組織塊包埋不完全，缺乏支撐作用都會引起切片皺縮或卷縮。應(yīng)對措施：注意及時更換刀片；保持防卷板的清潔，每做一例冷凍切片，均應(yīng)將刀口及防卷板拭擦干凈，防止切片的污染和切片皺縮。

2.6 細(xì)胞染色過淺或模糊不清 適當(dāng)延長固定、染色時間，當(dāng)蘇木精染色力下降時及時更換。脫水流程不能太快并定期更換脫水液。

2.7 產(chǎn)生空洞 原因是由于緩慢的冷凍使水分子向細(xì)胞間疏松區(qū)域游離、聚集，然后凝結(jié)成冰，當(dāng)切片快速放人固定液后，冰融化留下了空洞[7]。應(yīng)對措施：縮短冷凍時間，吸去多余水分。

3 冷凍切片操作規(guī)范與注意事項(xiàng)

3.1 術(shù)中冰凍組織切片前不能固定 如已經(jīng)福爾馬林固定的組織需補(bǔ)做冷凍切片，在常規(guī)取材后，用濾紙吸干周圍水分，置包埋托上加包埋劑，入液氮后取出，置于冷凍切片機(jī)冷凍臺上片刻，修切組織，切片，吹干，不需固定，直接染色[8]。

3.2 組織取材大小要適宜 組織過大，切片的阻力過大，易產(chǎn)生皺折，刀痕，造成組織崩解，增加切片難度，影響病理診斷。反之，組織過小，破碎，則不宜將組織包埋在同一個 水平面，影響切片操作，造成漏診或誤診[9]。

3.3 組織標(biāo)識要明確，重點(diǎn)部位的組織應(yīng)該標(biāo)識明確，明確組織的包埋方向?？梢赡[瘤的范圍，淋巴結(jié)和帶有包膜的組織，需要將整個切面暴露且含有整個包膜的存在。

3.4 包埋劑的量要適宜，過多損傷切片刀，過少起不到包埋作用。

3.5 冰凍時間太久不宜立即切片。

3.6 用于附粘的載玻片不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。

3.7 防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應(yīng)保持干凈。

4 討論

快速冰凍診斷的意義在于確定病變性質(zhì)（如判斷組織的良惡性），了解惡性腫瘤的擴(kuò)散情況，確定腫瘤手術(shù)切緣情況?？偨Y(jié)起來就是快和準(zhǔn)，在組織的厚度與大小確定后，技術(shù)員應(yīng)更多地摸索適合 本科室冷凍切片機(jī)的冷凍時間與溫度，在確保冷凍切片質(zhì)量的前提下，盡可能縮短制片時間[10]。制作良好的冷凍切片必備的三個條件（1）性能良好的冷凍切片機(jī)；（2）對冷凍切片技術(shù)掌握較好的技術(shù)員；（3）具有相當(dāng)臨床病理診斷經(jīng)驗(yàn)、經(jīng)過一定訓(xùn)練的病理醫(yī)生（副主任醫(yī)生級別以上），對冷凍切片造成的人為假象應(yīng)有一定的認(rèn)識[11]?？傊x擇合適的溫度與時間是保證冷凍切片質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)之一，應(yīng)根據(jù)本科的設(shè)備與條件制定最佳的冷凍制片方案。一張高質(zhì)量的冰凍切片，不僅要掌握重要的技術(shù)操作，還要高度的責(zé)任心，不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)，逐漸提高冰凍切片質(zhì)量，縮小與常規(guī)石蠟切片的差距，減少人為假象，為正確的病理診斷提供有力支持與保障。

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