翁祖桐

(福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，福建 福州 350002)

消化酶是一類參與食物營養(yǎng)消化吸收的蛋白質(zhì)，其活性高低直接影響了魚類對營養(yǎng)的吸收利用程度，進而影響其生長發(fā)育[1]。相關(guān)研究表明，魚類攝食后消化酶活性呈現(xiàn)動態(tài)變化的過程[2-3]。此外，消化酶活性還受溫度、鹽度、pH等環(huán)境因素的影響[4-7]。水溫作為最重要的環(huán)境因素之一，在消化酶活性變化過程中起到重要作用[8]。銀鯽(Carassiusgibelio)腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性分別在28℃、24℃、28℃達到最高值[9]；當溫度為16～28℃時，條石鯛(Oplegnathusfasciatus)幼魚的脂肪酶和蛋白酶活性較高、 淀粉酶活性較低[7]；星斑川鰈(Platichthysstellatus)胃蛋白酶活性的最適溫度為40℃，腸蛋白酶活性的最適溫度為45℃，肝胰腺蛋白酶活性的最適溫度為45℃[10]。

羅非魚是福建省主要的淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。針對羅非魚的消化酶活性，黎軍勝等[11]探究了飼料成分與環(huán)境溫度對羅非魚消化酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)在水溫17～32℃時，胃、肝胰臟、腸道的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性均隨溫度的升高而提高。由于羅非魚無乳鏈球菌病發(fā)病初始養(yǎng)殖水溫為26℃[12]和發(fā)病高峰期開始養(yǎng)殖水溫為30℃[13]，因此本實驗選擇在這2個水溫養(yǎng)殖下的羅非魚空腹一次性投喂后，研究其腸道胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的活性動態(tài)變化，旨在為羅非魚口服疫苗飼料的選擇、飼料配方的設計提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗魚

“新吉富”羅非魚由福建省淡水水產(chǎn)研究所榕橋中試基地提供，連續(xù)充氣，每日投餌1次，投餌量為魚體質(zhì)量的5%，每天換水1次，于0.6 m3體積水族箱內(nèi)暫養(yǎng)一周后使用。

1.2 主要試劑

胰蛋白酶測定試劑盒、淀粉酶測定試劑盒、脂肪酶測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 試驗設計

隨機挑選健康的“新吉富”羅非魚100尾，體重為67.15～100.65 g，體長為16.34～19.05 cm，平均分為2組，分別設置試驗養(yǎng)殖水溫為26℃和30℃，暫養(yǎng)1周，于試驗前停止投喂3 d。

1.4 樣品制備

停止投喂3 d后，取樣前按羅非魚魚體質(zhì)量的5%投喂基礎飼料1次，在投喂后0、1、3、6、12、24、30、36、48、56、96 h共 11個時間點各取試驗魚3尾，迅速敲擊魚頭部致其死亡，在冰盤上解剖，取出腸道，去除內(nèi)容物，以冷蒸餾水沖洗內(nèi)壁后，等分為三段[14](前、中、后腸)，濾紙吸干，分別稱重。加入9倍體積(V/W)0.85%生理鹽水，用勻漿器冰浴勻漿，4℃、2 500 r·min-1離心10 min，取上清液，4℃冰箱保存待測。

1.5 胰蛋白酶活性測定

采用紫外比色法進行羅非魚腸道各段胰蛋白酶活性測定，具體方法和計算方式參見胰蛋白酶測定試劑盒說明書。

胰蛋白酶活性(U/mgprot)定義：在37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化使吸光度變化0.003定義為一個酶活性單位。

1.6 淀粉酶活性測定

采用碘-淀粉比色法進行羅非魚腸道各段淀粉酶活性測定，具體方法和計算方式參見淀粉酶測定試劑盒說明書。

淀粉酶活性(U/mgprot)定義：在37℃條件下，每毫克組織蛋白與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為一個酶活性單位。

1.7 脂肪酶活性測定

采用比色法進行羅非魚腸道各段脂肪酶活性測定，具體方法和計算方式參見脂肪酶測定試劑盒說明書。

脂肪酶活性(U/gprot)定義：在37℃條件下，每克組織蛋白在其反應體系中與底物反應1 min，每消耗1 μmol底物定義為一個酶活性單位。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 胰蛋白酶活性

在26℃和30℃養(yǎng)殖水溫下攝食后，羅非魚前、中、后腸的胰蛋白酶活性基本呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖1-a、1-b、1-c)。在26℃養(yǎng)殖水溫下，前、中、后腸胰蛋白酶活性分別從攝食后0 h、3 h和3 h開始升高，分別在12 h、24 h和24 h達到最高值，活性值分別為2 989.03 U/mgprot、3 148.62 U/mgprot和4 324.69 U/mgprot，分別是初始酶活性值的1.25倍、1.45倍和1.42倍；在30℃養(yǎng)殖水溫下，前、中、后腸胰蛋白酶活性分別從攝食后0 h、0 h和0 h開始升高，分別在24 h、30 h和30 h達到最高值，活性值分別為4 891.47 U/mgprot、3 410.79 U/mgprot和5 329.96 U/mgprot，分別是初始酶活性值的1.96倍、1.52倍和1.63倍。30℃養(yǎng)殖水溫下的腸道各段胰蛋白酶活性在1～48 h時均大于2 581.22 U/mgprot，而26℃養(yǎng)殖水溫下的腸道各段胰蛋白酶活性僅在6～30 h時均大于2 558.94 U/mgprot。30℃養(yǎng)殖水溫下的腸道各段胰蛋白酶活性最高值高于26℃養(yǎng)殖水溫，除中腸差異不顯著(P>0.05)外，其余各段均差異顯著(P<0.05)。在腸道各段中，26℃水溫下的胰蛋白酶活性大小依次為后腸>中腸>前腸，30℃水溫下的胰蛋白酶活性大小依次為后腸>前腸>中腸。

2.2 淀粉酶活性

在26℃和30℃養(yǎng)殖水溫下攝食后，羅非魚前、中、后腸的淀粉酶活性基本呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖2-a、2-b、2-c)。在26℃養(yǎng)殖水溫下，前、中、后腸淀粉酶活性分別從攝食后0 h、12 h和0 h開始升高，分別在12 h、30 h和30 h達到最高值，活性值分別為17.61 U/mgprot、23.52 U/mgprot和28.22 U/mgprot，分別是初始酶活性值的1.43倍、1.54倍和1.73倍；在30℃養(yǎng)殖水溫下，前、中、后腸淀粉酶活性分別從攝食后0 h、6 h和0 h開始升高，分別在36 h、36 h和30 h達到最高值，活性值分別為19.87 U/mgprot、58.77 U/mgprot和35.24 U/mgprot，分別是初始酶活性值的1.45倍、3.82倍和1.88倍。30℃養(yǎng)殖水溫下的腸道各段淀粉酶活性在3～48 h時均大于16.18 U/mgprot，而26℃養(yǎng)殖水溫下的腸道各段胰蛋白酶活性僅在3～36 h時均大于15.02 U/mgprot。30℃養(yǎng)殖水溫下的腸道各段淀粉酶活性最高值均高于26℃養(yǎng)殖水溫，并表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)。在腸道各段中，26℃水溫下的淀粉酶活性大小順序為后腸>中腸>前腸，30℃水溫下的淀粉酶活性大小順序為中腸>后腸>前腸。

2.3 脂肪酶活性

在26℃和30℃養(yǎng)殖水溫下攝食后，羅非魚前、中、后腸的脂肪酶活性基本呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖3-a、3-b、3-c)。在26℃養(yǎng)殖水溫下，前、中、后腸脂肪酶活性分別從攝食后3 h、1 h和1 h開始升高，分別在24 h、30 h和24 h達到最高值，活性值分別為25.74 U/gprot、15.25 U/gprot和16.44 U/gprot，分別是初始酶活性值的2.71倍、1.86倍和2.13倍；在30℃養(yǎng)殖水溫下，前、中、后腸脂肪酶活性分別從攝食后1 h、0 h和0 h開始升高，分別在12 h、24 h和24 h達到最高值，活性值分別為43.73 U/gprot、23.96 U/gprot和20.12 U/gprot，分別是初始酶活性值的4.58倍、2.06倍和2.40倍。30℃養(yǎng)殖水溫下的腸道各段脂肪酶活性在3～36 h時均大于11.87 U/mgprot，而26℃養(yǎng)殖水溫下的腸道各段脂肪酶活性僅在12～30 h時均大于10.27 U/mgprot。30℃養(yǎng)殖水溫下的腸道各段脂肪酶活性最高值高于26℃養(yǎng)殖水溫，并且差異顯著(P<0.05)。在腸道各段中，26℃水溫下的脂肪酶活性大小順序為前腸>后腸>中腸，30℃水溫下的脂肪酶活性大小順序為前腸>中腸>后腸。

3 討論

3.1 水溫對消化酶活性的影響

水溫作為最重要的環(huán)境因子之一，影響著魚類消化酶活性的變化。據(jù)報道魚類消化酶的最適溫度一般為30～50℃[15]。泥鰍腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的最適溫度分別為40℃、45℃和35℃；肝胰臟蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的最適溫度分別為30℃、40℃和35℃[16]。針對羅非魚，研究發(fā)現(xiàn)在17～32℃溫度范圍內(nèi)，消化酶活性隨著水溫的升高而上升[11]。本研究結(jié)果表明在30℃養(yǎng)殖水溫條件下的腸道胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等消化酶活性均高于26℃養(yǎng)殖水溫條件，且30℃養(yǎng)殖水溫下的腸道各段消化酶較高活性水平持續(xù)時間比26℃養(yǎng)殖水溫更長，與上述研究結(jié)論一致。由此可以推斷，在不同的養(yǎng)殖水溫下，由于消化酶活性的差異，羅非魚對飼料的消化吸收能力也會隨之改變。因此在羅非魚實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，應根據(jù)不同地區(qū)、不同時間的環(huán)境溫度特點，及時有針對性地調(diào)整投喂飼料量和配方，以取得最佳養(yǎng)殖效益。

3.2 消化酶的組織差異性

相關(guān)研究表明，羅非魚表現(xiàn)為以植食性為主的雜食性魚類特征，腸道較肉食性魚類長，盤曲多，食物在腸道中移動滯留的時間相對較長，因此推測出腸道在羅非魚食物消化中比其他消化器官起到更重要的作用[17]。本研究選擇羅非魚腸道為研究對象，并對比了腸道各段的消化酶活性，結(jié)果顯示在30℃養(yǎng)殖水溫下，胰蛋白酶活性水平在后腸最高，淀粉酶活性水平在中腸最高，脂肪酶活性水平在前腸最高。在唇魚骨(Hemibarbuslabeo)上的相關(guān)研究表明，唇魚骨的蛋白酶活性大小順序為前腸>中腸>后腸，淀粉酶活性大小順序為中腸>后腸>前腸，脂肪酶活性大小順序為中腸>前腸>后腸[18]。而對鲇魚(Plecoglossusaltivelis)的研究則發(fā)現(xiàn)，在最適溫度下，蛋白酶活力順序為前腸>中腸>后腸，淀粉酶的活力順序為前腸>中腸>后腸，脂肪酶的活力順序為前腸>中腸>后腸[19]。幾種魚類消化酶的組織差異性結(jié)果存在較大差異，推測可能與腸道消化酶活性受魚種類別、投喂方式、餌料種類、環(huán)境因子、食性等因素影響有關(guān)[20]。

羅非魚口服疫苗因其實施方便、對魚體無損傷等特點，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中越來越受到關(guān)注。本研究通過攝食后腸道各段消化酶活性的動態(tài)變化，對羅非魚的消化機制進行了初步探討，為羅非魚口服疫苗的開發(fā)、飼料配方的設計提供了研究基礎。

致謝：感謝福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站吳斌高級工程師、福建省淡水水產(chǎn)研究所林煜高級工程師和鐘全福高級工程師等對本研究提供的支持和幫助。