白細(xì)胞介素-12基因缺陷促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞浸潤(rùn)改善缺血再灌注后心肌損傷的研究

李玉琳 張言真子 陳博雅 杜 杰

缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是指在心肌缺血基礎(chǔ)上由于心肌再灌注引起的二次損傷，是心肌梗死患者血運(yùn)重建后心臟不良事件發(fā)生和死亡的主要原因[1-2]。對(duì)于已經(jīng)接受冠狀動(dòng)脈血運(yùn)重建治療的心肌梗死患者，減輕手術(shù)后心肌IRI，最大限度保護(hù)缺血心肌非常重要。白細(xì)胞介素-12(interleukin-12, IL-12)是巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子，由p35和p40亞基組成[3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-12p35亞基(interleukin-12 subunit p35,IL-12p35)調(diào)控單核細(xì)胞向不同類型巨噬細(xì)胞分化，參與高血壓心臟纖維化和心肌梗死后心臟修復(fù)[4-5]。以上均提示IL-12有可能參與缺血再灌注損傷。本研究將通過(guò)IL-12p35基因缺陷小鼠構(gòu)建心肌IRI模型進(jìn)一步探討IL-12調(diào)控心肌損傷的病理機(jī)制。

材料與方法

1.材料及分組 (1)材料：雄性，C57小鼠，16只, 購(gòu)自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；雄性，IL-12p35基因敲除型(IL-12p35 缺陷)小鼠，16只, 購(gòu)自美國(guó)The Jackson Laboratory。所有的動(dòng)物的使用均遵循美國(guó)健康國(guó)立研究所出版的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照料和使用指南和首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照料和使用規(guī)則。Protein G Agrose/ Salmon Sperm DNA(美國(guó)Millipore公司)；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)試劑盒(美國(guó)羅氏公司)；抗CXCR4、抗VEGFR一抗(美國(guó)Abcam公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記免疫組化二抗(中國(guó)北京中杉金橋公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)。

(2)分組：分成四組：野生型 (WT)假手術(shù)組；白細(xì)胞介素-12p35亞基(IL-12p35)基因缺陷假手術(shù)組；WT手術(shù)組；IL-12p35基因缺陷手術(shù)組。

2.實(shí)驗(yàn)方法 (1)小鼠缺血再灌注模型：小鼠稱質(zhì)量后用異氟烷 (35 mg /kg) 吸入麻醉，麻醉誘導(dǎo)時(shí)間約2 min；用脫毛膏脫去小鼠胸部的毛，將小鼠平躺并固定，使用75%乙醇皮膚消毒；開(kāi)胸位點(diǎn)選擇左側(cè)肋骨3～4 肋間，用眼科剪在此位置開(kāi)口尺寸 0. 5～1. 0 cm；將小鼠心臟擠出；于左心耳右下緣2 mm處以6. 0絲線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，局部心肌由紅色變?yōu)榘咨?，提示結(jié)扎成功；45min后解開(kāi)結(jié)扎，關(guān)閉胸腔，用3/0的棉線縫合皮膚。假手術(shù)組小鼠也接受同樣的手術(shù)步驟，但是環(huán)繞前降支的線不結(jié)扎。

(2)組織切片制備：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死小鼠，使用0.9%氯化鈉液進(jìn)行心臟灌流。心臟內(nèi)注射10 %氯化鉀，使其停跳于舒張末期。心臟于10%甲醛溶液中固定后立埋于石蠟包塊中(心底向下，心尖向上)，5μm切片，自顯露乳頭肌后收片，將組織切片置于多聚賴氨酸涂層玻片上。

(3)流式細(xì)胞術(shù)[6]：處死小鼠后取結(jié)扎線以下的缺血再灌注部位心臟組織，在medium A中洗3次；將心臟轉(zhuǎn)入少量A中，用剪刀剪成1mm2左右的碎塊；將碎塊轉(zhuǎn)入2mL消化液1中，37℃, 25min；1 200r/min，離心8min，棄上清，加A洗一次，棄上清；加入1mL消化液2，37℃,45min；加入A稀釋消化液后，過(guò)300目細(xì)胞篩，1 200 r/min離心8min，棄上清，加A洗一次，棄上清；加PBS或鞘液，1 200 r/min，離心8min，棄上清，加入100μL PBS重懸細(xì)胞；加入Sca-1、CD34、VEGFR、CXCR4流式抗體，4℃避光,孵育30min，加PBS終止抗原抗體反應(yīng)，1 200r/min離心5min，棄上清，加入約500μL PBS重懸細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)表面染色后準(zhǔn)備流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

(4)免疫組織化學(xué)染色：1×檸檬酸中抗原高壓熱修復(fù)，ddH2O洗2次，各3min；內(nèi)源性過(guò)氧化酶阻斷劑20min，PBS洗3次，各3min；血清封閉，室溫20min；甩干，加一抗抗體，4℃濕盒過(guò)夜；取出濕盒，室溫放置20min，PBS洗3次，各3min；加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗抗體 30min，PBS洗3次，各3min；DAB顯色；蘇木素復(fù)染3min，自來(lái)水洗，鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗5min；脫水、透明、封片及鏡檢。使用Nikon ECLIPSE 90i顯微鏡進(jìn)行切片觀察，采用400倍視野采圖。

(5)小鼠心臟組織RNA的檢測(cè)：RNA提取按Trizol提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取缺血再灌注后小鼠梗死區(qū)、周邊區(qū)和遠(yuǎn)端區(qū)心臟組織放入勻漿器，加入1 mL Trizol提取RNA，用Nanodrop 2 000測(cè)定RNA的濃度和OD260 /280 比值。按試劑盒說(shuō)明將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別加入2×SYBR Green PCR Master Mix 10μL、RNase Free H2O 9μL和上下游引物各0.5μL，混勻。每管總反應(yīng)體系20μL，加入到上述各管中，進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，按照特定最適退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增。采用Bio-Rad iQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行融解曲線分析后獲得可靠CT值曲線。引物序列分別為: VEGFR∶5′-TGGCTCTACGACCTTAGACTG-3′ (上游)，5′-CAGGTTTGACTTGTCTGAGGTT-3′(下游)；CXCR4∶5′-CTTCTGGGCAGTTGATGCCAT-3′(上游)，5′-CTGTTGGTGGCGTGGACAAT-3′(下游)；IFN-γ：5′-ATGAACGCTACACACTGCATC-3′ (上游)，5′-CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC-3′(下游)；GM-CSF：5′-TCGTCTCTAACGAGTTCTCCTT-3′ (上游)，5′-CGTAGACCCTGCTCGAATATC-3′(下游)；GAPDH:5′-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3′(上游)，5′-GCGGCACGTCAGATCCA-3′(下游)。

(6)心臟超聲的測(cè)定:應(yīng)用1%的戊巴比妥鈉(50mg/kg)進(jìn)行腹腔注射麻醉；用脫毛膏將小鼠胸部的毛發(fā)脫去；將小鼠平躺并固定；用連接好的探頭對(duì)動(dòng)物開(kāi)始掃描成像，并保存圖像；將所保存的圖像導(dǎo)入分析軟件中進(jìn)行分析，將算出的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

圖1 WT和IL-12p35基因缺陷小鼠缺血再灌注術(shù)后心肌纖維化面積 A：WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心臟組織 Masson 染色心臟橫截面圖(×40，500μm)；B：WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心臟組織 Masson 染色陽(yáng)性面積, 注: 與對(duì)照組相比，*P<0.05

3. 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。符合正態(tài)分布的測(cè)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析, 偏態(tài)分布的計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. IL-12基因缺陷促進(jìn)缺血再灌注后心臟修復(fù) IL-12p35基因缺陷和同窩對(duì)照小鼠行缺血再灌注手術(shù)。術(shù)后14天收取心臟組織，病理顯示IL-12 p35基因缺陷小鼠心臟纖維化面積顯著小于同窩對(duì)照小鼠(圖1)。超聲顯示缺血再灌注后小鼠較假手術(shù)組心臟收縮功能下降，缺血再灌注手術(shù)組中IL-12 p35基因缺陷小鼠射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)高于同窩對(duì)照組(表1)，表明IL-12 p35基因缺陷促進(jìn)缺血再灌注后心臟修復(fù)和心功能。

表1 WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心功能

注： IVS:d室間隔舒張末期厚度；LVID:d左心室舒張期內(nèi)徑；LVID:s左心室收縮期內(nèi)徑；LVPW:s左心室后壁收縮期厚度；LVPW:d左心室后壁舒張期厚度；EF：射血分?jǐn)?shù),注: IR：4W，與對(duì)照組相比，*P<0.05

2. IL-12基因缺陷不影響心肌細(xì)胞凋亡 缺血再灌注致心肌細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致心肌損傷的主要原因之一。IL-12p35基因缺陷和同窩對(duì)照小鼠行缺血再灌注手術(shù)，術(shù)后1天收取心臟組織TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡結(jié)果表明, IL-12基因缺陷小鼠與同窩對(duì)照小鼠心肌細(xì)胞凋亡,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 2)。

圖2 WT和IL-12p35基因缺陷小鼠缺血再灌注術(shù)后心肌凋亡數(shù)量 A：WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心臟組織 TUNEL染色(×40，500μm)；B：WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心臟組織TUNEL染色陽(yáng)性面積, 注: 與對(duì)照組相比，* P <0.05

圖3 WT和IL-12p35基因缺陷小鼠缺血再灌注術(shù)后心臟中EPC趨化因子GM-CSF表達(dá)及EPCs數(shù)量 A：WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心臟中GM-CSF、VEGF-R、CXCR4 mRNA表達(dá)水平；B：WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心臟組織免疫組化VEGFR、CXCR4染色(×400，50μm)；C：WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心臟組織免疫組化染色陽(yáng)性面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果；D：用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心臟組織中Sca-1+CD34+VEGFR+CXCR4+細(xì)胞；E：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心臟組織中Sca-1+CD34+VEGFR+CXCR4+ 細(xì)胞數(shù)量 注: 與對(duì)照組相比，*P<0.05

3. IL-12p35基因缺陷小鼠缺血再灌注術(shù)后心臟中EPC細(xì)胞增加 缺血再灌注后7天后,檢測(cè)心臟中EPC招募相關(guān)的趨化因子(GM-CSF)表達(dá)以及EPC細(xì)胞表面受體CXCR4和VEGFR表達(dá)。qRT-PCR檢測(cè)顯示, 缺血再灌注后心臟中GM-CSF, CXCR4和VEGFR的mRNA表達(dá)顯著升高(圖3A)。IL-12p35基因缺陷和同窩對(duì)照小鼠行缺血再灌注手術(shù)。術(shù)后7天收取心臟組織，免疫組化染色顯示， IL-12p35基因缺陷小鼠再灌注區(qū)域VEGFR，CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞面積顯著高于對(duì)照組(圖 3B～C)。流式檢測(cè)心臟中浸潤(rùn)的Sca-1+CD34+VEGFR+CXCR4+的EPC細(xì)胞，缺血再灌注后心臟中EPC細(xì)胞高于假手術(shù)組；與對(duì)照組相比，IL-12p35基因缺陷小鼠再灌注部位中EPC細(xì)胞比例高于對(duì)照組小鼠(1.0%vs. 0.38%)(圖 3D～E)。以上結(jié)果表明IL-12p35基因缺陷小鼠缺血再灌注后心臟中EPC細(xì)胞增加。

圖4 WT和IL-12p35基因缺陷小鼠缺血再灌注術(shù)后心臟中IFN-γ及GM-CSF表達(dá) A：WT和IL-12p35 基因缺陷小鼠缺血再灌注術(shù)后心臟中IFN-γ mRNA表達(dá)水平；B：WT和IL-12p35 基因缺陷小鼠缺血再灌注術(shù) 后心臟中GM-CSF mRNA表達(dá)水平

4.IL-12抑制GM-CSF表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)表明，缺血再灌注后心臟中IFN-γ和GM-CSF表達(dá)增加，與缺血再灌注后同窩對(duì)照小鼠相比，IL-12p35基因缺陷小鼠心臟中IFN-γ表達(dá)下降，但GM-CSF表達(dá)增加(圖 4)。

討 論

本研究利用IL-12p35基因缺陷小鼠構(gòu)建缺血再灌注模型，闡明了IL-12在小鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用，IL-12敲除后可降低IRI后心肌纖維化面積，改善小鼠心功能(提高射血分?jǐn)?shù)等心功能指數(shù))，但不影響心肌細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)IL-12基因缺陷通過(guò)抑制IFN-γ減少對(duì)趨化因子GM-CSF的抑制，促進(jìn)梗死區(qū)EPC的浸潤(rùn)、血管生成、挽救瀕死心肌。

IL-12由巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞分泌，主要通過(guò)與NK細(xì)胞和T細(xì)胞上的IL-12受體結(jié)合，誘導(dǎo)TNF-γ的產(chǎn)生，從而促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[7]。近年來(lái)IL-12作用機(jī)制的相關(guān)研究已經(jīng)涉及除感染以外的多種疾病，越來(lái)越多的證據(jù)表明IL-12在心血管疾病起重要作用。例如，IL-12基因缺陷通過(guò)內(nèi)皮一氧化氮合酶/Akt/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2/氧化應(yīng)激-炎癥依賴的信號(hào)通路促進(jìn)2型糖尿病小鼠的血管生成及血流恢復(fù)[8]；ST段抬高型心肌梗死患者血清中IL-12顯著升高[9]；動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的免疫細(xì)胞分泌IL-12刺激活化的T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ[10]，IFN-γ通過(guò)降低膠原產(chǎn)生、平滑肌細(xì)胞增殖進(jìn)一步促進(jìn)斑塊進(jìn)展和破裂[11]。本課題組的前期研究顯示急性心肌梗死后IL-12表達(dá)增加，通過(guò)調(diào)控單核細(xì)胞血管新生和炎癥相關(guān)基因表達(dá)，參與影響心臟損傷和重塑過(guò)程。

心臟缺血再灌注損傷的機(jī)制并未完全闡明，其中血管新生障礙在其中起著重要作用；由血管內(nèi)皮細(xì)胞引起的血管新生在心肌梗死早期可挽救缺血心肌，因此促血管新生被公認(rèn)是治療急性心肌梗死的潛在治療策略。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)來(lái)源于造血干細(xì)胞，主要維持內(nèi)皮完整性和功能并促進(jìn)血管新生[12-13]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)， EPC具有歸巢于血管損傷部位的能力，參與缺血性心肌損傷的修復(fù)[14]。我們檢測(cè)了對(duì)照小鼠和心肌梗死后小鼠心臟梗死區(qū)和交界區(qū)EPC細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)心肌梗死后EPC從骨髓動(dòng)員至梗死區(qū)浸潤(rùn)增加，參與心肌修復(fù)和血管再生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)相比于野生小鼠，IL-12p35基因缺陷小鼠缺血再灌注后心臟中EPC細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加。

趨化因子是作為化學(xué)引誘物誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的一類蛋白[15]，EPC的動(dòng)員由趨化因子粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)介導(dǎo)，可以促進(jìn)EPC募集至缺血組織中并促進(jìn)新生血管生成[14]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-12可以抑制輔助性T細(xì)胞(helper T cells, Th)產(chǎn)生GM-CSF，IL-12受體敲除的Th細(xì)胞可以產(chǎn)生更多的GM-CSF；并且給予中和抗體阻斷IL-12后，Th細(xì)胞產(chǎn)生GM-CSF也會(huì)增多[16]。因此，我們檢測(cè)了缺血再灌注7天后心臟中GM-CSF的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷后心臟中GM-CSF的表達(dá)量升高。我們之前研究發(fā)現(xiàn)IL-12基因缺陷后抑制T細(xì)胞向Th1型分化，從而減少對(duì)GM-CSF表達(dá)的抑制。我們檢測(cè)了缺血再灌注模型后心臟IFN-γ和GM-CSF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IL-12p35基因缺陷小鼠心臟中IFN-γ的表達(dá)減少，而GM-CSF的表達(dá)增加。

綜上所述，本研究進(jìn)一步揭示和證明了IL-12基因缺陷對(duì)于心肌IRI的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是IL-12基因缺陷可以通過(guò)抑制IFN-γ表達(dá)減少對(duì)趨化因子GM-CSF的抑制，促進(jìn)EPC向缺血心肌部位的浸潤(rùn)，從而促進(jìn)血管生成、挽救瀕死心肌。本研究為逆轉(zhuǎn)臨床上發(fā)生的心肌缺血再灌注損傷及后續(xù)的心力衰竭提供了新的治療思路和靶點(diǎn)。