周曉斌 劉莉 李永光 孫俊 陳寅

650111 昆明，武警云南總隊(duì)醫(yī)院內(nèi)一科(周曉斌)，醫(yī)務(wù)處(劉莉、李永光、孫俊)，病理科(陳寅)

鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子2(Krüppel-like transcription factor 2，KLF2)隸屬于Spl/Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族，不僅在胚胎血管內(nèi)皮表達(dá)，參與維持血管正常形態(tài)的發(fā)育[1]，而且具有抗炎、抗增殖、抗凝的作用。在循環(huán)系統(tǒng)中，KLF2是維持血管完整性的重要因子；在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，被譽(yù)為“分子開關(guān)”；在粥樣硬化病變中參與多種因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。近年相關(guān)研究提示，KLF2與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)[2]。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，在載脂蛋白E基因敲除小鼠主動(dòng)脈的不穩(wěn)定斑塊中KLF2表達(dá)明顯減少[3]。然而目前對(duì)KLF2與冠心病的關(guān)系鮮見人體研究報(bào)道。因此，本研究通過檢測(cè)KLF2在冠心病患者血清中的含量，探討人體內(nèi)KLF2與冠心病及斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

本研究為非隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)。入選2013—2016年武警云南總隊(duì)醫(yī)院和圣·約翰醫(yī)院共79例住院患者，其中男性51例，女性28例，年齡25～86歲，平均(59±14)歲。將患者分為3組：不穩(wěn)定斑塊組45例、穩(wěn)定斑塊15例和對(duì)照組19例。分組標(biāo)準(zhǔn)[4]：(1)不穩(wěn)定斑塊組：冠狀動(dòng)脈造影顯示冠狀動(dòng)脈狹窄，頸動(dòng)脈超聲可見軟斑塊，近1年內(nèi)發(fā)作過急性冠狀動(dòng)脈綜合征，入院前未規(guī)律服用他汀類藥物；(2)穩(wěn)定斑塊組：冠狀動(dòng)脈造影顯示冠狀動(dòng)脈狹窄，頸動(dòng)脈超聲可見硬斑塊，近1年內(nèi)未發(fā)作過急性冠狀動(dòng)脈綜合征，入院前未規(guī)律服用他汀類藥物；(3)對(duì)照組：無心血管疾病病史及家族史，頸動(dòng)脈超聲未見斑塊，入院前未服用過他汀類藥物。3組間性別、年齡構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)發(fā)病前1個(gè)月有重大外傷或手術(shù)史；(2)有嚴(yán)重心臟、肝臟、腎臟等器官功能衰竭；(3)患慢性炎癥性或感染性疾??；(4)近期(6個(gè)月內(nèi))有非冠狀動(dòng)脈血栓性疾??；(5)妊娠。本研究經(jīng)醫(yī)院道德倫理委員會(huì)許可(醫(yī)倫【2013】002號(hào))，所有患者均簽署知情同意書。

表1 患者分組情況

注：ACS：急性冠狀動(dòng)脈綜合征；“—”代表無此項(xiàng)；與其他兩組比較，aP>0.017

1.2 儀器與試劑

儀器：PHILIPS Envisor-HD彩色多普勒超聲儀(菲利浦公司，美國)，KHB ST-360007自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(科華公司，中國)；FYL-YS-100L恒溫箱(福意公司，中國)。試劑：Human KLF2 Elisa 試劑盒(華美公司，中國)。

1.3 超聲檢測(cè)頸動(dòng)脈斑塊

用高分辨率彩色多普勒超聲儀觀察頸動(dòng)脈斑塊的特征及測(cè)量各項(xiàng)參數(shù)?；颊呷∑脚P位，頭略后仰并偏向檢查對(duì)側(cè)，充分暴露頸部，探頭輕放患者頸部體表，囑患者平靜呼吸。首先對(duì)患者雙側(cè)頸總動(dòng)脈分叉處進(jìn)行檢查。硬斑塊富含纖維組織，在超聲下顯示為均一的高回聲；軟斑塊由薄的纖維環(huán)包繞大的脂質(zhì)池構(gòu)成，多顯示為低回聲或不均一的混合回聲。測(cè)量頸動(dòng)脈斑塊體積(長×寬×高)，斑塊纖維帽厚度，內(nèi)膜中層厚度，計(jì)算平均斑塊體積=[(左側(cè)斑塊體積+右側(cè)斑塊體積)/2]，平均斑塊纖維帽厚度[(左側(cè)斑塊纖維帽厚度+右側(cè)斑塊纖維帽厚度)/2]，平均內(nèi)膜中層厚度=[(左側(cè)斑塊內(nèi)膜中層厚度+右側(cè)斑塊內(nèi)膜中層厚度)/2]，斑塊穩(wěn)定性=平均纖維帽厚度/平均內(nèi)膜中層厚度。

1.4 ELISA法檢測(cè)血清中KLF2含量

患者清晨空腹取血離心后分裝凍存，將血清樣本從-80℃冰箱中取出，室溫下預(yù)溫30 min。配制不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，加樣，100 μl/孔，37℃恒溫箱孵育2 h，傾棄每孔液體，不洗。每孔加100 μl生物素抗體(Biotin-antibody，1×)，37℃孵育1 h，洗板3次。每孔加100 μl辣根過氧化物酶抗生物素蛋白(HRP-avidin，1×)，37℃孵育1 h，洗板5次。每孔加90 μl四甲基聯(lián)苯胺(TMB)呈色底物，37℃避光孵育30 min。每孔加50 μl終止液，5 min之內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm波長下的OD值。繪制4參數(shù)曲線，計(jì)算出樣本KLF2濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不穩(wěn)定斑塊組患者斑塊穩(wěn)定性較差

通過超聲測(cè)量頸動(dòng)脈斑塊發(fā)現(xiàn)，與穩(wěn)定斑塊組比較，不穩(wěn)定斑塊組斑塊體積較大[(10.24±5.05)mm3比 (5.41±2.99)mm3，P<0.01]，斑塊纖維帽厚度較薄[(0.86±0.19)mm 比 (1.28±0.32)mm，P<0.01]，斑塊內(nèi)膜中層厚度較厚[(2.79±0.19)mm 比 (1.99±0.37)mm，P<0.01]，斑塊穩(wěn)定性較差(0.35±0.14 比 0.66±0.17，P<0.01)，見表2。進(jìn)一步ROC曲線分析顯示，斑塊穩(wěn)定性評(píng)估(平均纖維帽厚度/平均內(nèi)膜中層厚度)的截?cái)嘀凳?.47(P<0.01)，靈敏度和特異度分別為86.67%和80.00%。

2.2 KLF2在冠心病患者血清中的含量較低

與對(duì)照組相比，不穩(wěn)定斑塊組+穩(wěn)定斑塊組的KLF2含量明顯降低[(0.88±0.75)pg/ml 比(5.04±3.07)pg/ml，P<0.01]。

2.3 KLF2在不穩(wěn)定斑塊患者血清中的含量較低

與對(duì)照組比較，KLF2在不穩(wěn)定斑塊組中的含量較低[(0.59±0.22)pg/ml比(5.04±3.07)pg/ml，P<0.01]；與穩(wěn)定斑塊組比較，KLF2在不穩(wěn)定斑塊組中的含量較低[(0.59±0.22)pg/ml 比(1.77±1.05)pg/ml，P<0.01]。

表2 超聲測(cè)量頸動(dòng)脈斑塊結(jié)果

注：與穩(wěn)定斑塊組比較，aP<0.01；“—”代表無此項(xiàng)

2.4 血清中KLF2含量與斑塊穩(wěn)定性的相關(guān)性

相關(guān)分析顯示，血清中KLF2的含量與斑塊穩(wěn)定性呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)(r)=0.534(P<0.01)。

3 討論

以往的基礎(chǔ)研究可為KLF2在抗動(dòng)脈粥樣硬化中扮演的角色提供一些證據(jù)。最初發(fā)現(xiàn)，KLF2基因的缺失可導(dǎo)致或加重動(dòng)脈粥樣硬化病變[5]，表明KLF2在動(dòng)脈粥樣硬化中有重要作用。深入的研究提示，KLF2可能通過斑塊中的內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及多種機(jī)制參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展[2，6]。

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，在載脂蛋白E基因敲除小鼠的冠心病動(dòng)物模型中，KLF2在其主動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊中的表達(dá)明顯減少[3]。本研究通過檢測(cè)KLF2在冠心病患者血清中的含量，發(fā)現(xiàn)KLF2不僅在冠心病患者血清中含量較低，而且在不穩(wěn)定斑塊患者血清中的含量也降低；相關(guān)分析顯示，KLF2與斑塊穩(wěn)定性呈正相關(guān)。因此，在人體較為復(fù)雜的真實(shí)環(huán)境中，KLF2仍與冠心病相關(guān)。

根據(jù)以往研究推測(cè)，一旦KLF2含量減少，可能導(dǎo)致組成斑塊的內(nèi)皮細(xì)胞受損[6]，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞粘附并分泌炎性介質(zhì)，脂肪細(xì)胞分化增加，平滑肌細(xì)胞增殖遷移，從而斑塊的穩(wěn)定性被削弱，心血管事件的發(fā)生率增加。

由于冠狀動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性的檢查(如冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)超聲)目前難以在臨床普及應(yīng)用，本研究采用四維入組標(biāo)準(zhǔn)(冠狀動(dòng)脈造影+頸動(dòng)脈超聲+急性冠狀動(dòng)脈綜合征的發(fā)作+他汀的使用)來盡量提高不穩(wěn)定斑塊患者評(píng)估的客觀性。近年來國外有研究顯示，頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)膜中層厚度和斑塊積分可很好地代表冠心病患者冠狀動(dòng)脈病變的程度[7]。本研究借鑒并拓展了頸動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性的評(píng)估方式，測(cè)量了頸動(dòng)脈斑塊的體積、纖維帽厚度、內(nèi)膜中層厚度，從而計(jì)算出斑塊的穩(wěn)定性，且以上數(shù)據(jù)采用雙側(cè)頸動(dòng)脈斑塊取平均值的方式，使得評(píng)估更科學(xué)。根據(jù)本研究所得數(shù)據(jù)分析，不穩(wěn)定斑塊組患者頸動(dòng)脈內(nèi)的斑塊與穩(wěn)定斑塊組相比，具有更大的斑塊體積和內(nèi)膜中層厚度，以及更薄的纖維帽，因此穩(wěn)定性更差。本研究顯示，頸動(dòng)脈超聲測(cè)量平均纖維帽厚度/平均內(nèi)膜中層厚度的比值如果超過0.47，則患者體內(nèi)斑塊易損的可能性越大。然而，本研究的分組畢竟缺乏客觀的血管內(nèi)影像評(píng)估，且樣本量小，其客觀性及代表性也受到了一定的局限。

綜上，KLF2在冠心病患者血清中的含量較低，也許是冠心病的一個(gè)特征信號(hào)，KLF2與不穩(wěn)定斑塊的相關(guān)性可能為冠心病的治療提供新的思路。然而，將來還需更多的研究為此提供證據(jù)。

利益沖突：無