王家啟 張 曦 李 莉

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor)是指能與基因啟動(dòng)子區(qū)域特定的順式作用元件相互結(jié)合，激活或抑制相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄，在信號(hào)通路中起承上啟下作用的關(guān)鍵蛋白[1]。在逆境脅迫響應(yīng)過程中起作用的轉(zhuǎn)錄因子是植物中非常重要的一類調(diào)節(jié)基因，它們可以通過形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，在時(shí)空兩個(gè)維度上共同調(diào)控各類基因的表達(dá)，因而是提高植物對(duì)逆境的抗性以及優(yōu)良性狀改良的一種更加行之有效的潛在工具[2～3]。近年來，很多研究者對(duì)能夠被非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因產(chǎn)生了濃厚的興趣，期望通過研究這些基因的分子作用機(jī)制來揭開植物逆境生長(zhǎng)的謎團(tuán)，從而利用基因工程的手段來提高植物抵御各類非生物脅迫的能力。到目前為止，許多與非生物脅迫有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因相繼被克隆出來，如AP2/EREBP、MYB、NAC、WRKY、HSF、ZFP和bHLH等[4～5]。

同源異型域—亮氨酸拉鏈(HD-Zip)蛋白是植物界所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控植物特有的生長(zhǎng)發(fā)育過程。HD-Zip包含一個(gè)由61個(gè)氨基酸構(gòu)成的高度保守的同源異型域HD(Homeodomain，HD)和緊隨其后的亮氨酸拉鏈(Leucine zipper,LZ)結(jié)構(gòu)域[6]。根據(jù)序列的保守性、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、功能以及其他特征，將HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子分成HD-ZipⅠ、HD-ZipⅡ、HD-Zip Ⅲ和HD-Zip Ⅳ4個(gè)亞家族[7～8]。HD-ZipⅠ亞家族基因進(jìn)化相對(duì)保守，分別在羧基端(carboxyl-terminal region,CTR)和氨基端(amino-terminal region,NTR)分布著一些保守結(jié)構(gòu)[9]。研究表明，HD-ZipⅠ蛋白主要參與植物光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]、葉片和種子發(fā)育調(diào)節(jié)[11～12]以及植物對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)等過程[13～14]；HD-Zip Ⅱ亞家族由半胱氨酸(Cys)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)構(gòu)成，其特有的保守結(jié)構(gòu)域是CPSCE[15]，在介導(dǎo)植物對(duì)光質(zhì)改變的應(yīng)答[16]、避蔭反應(yīng)[17]和非生物脅迫響應(yīng)[18]等過程中發(fā)揮著重要作用；HD-Zip Ⅲ亞家族的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除具有HD和Zip結(jié)構(gòu)域外，從N端到C端還含有START(steroidogenic acute regulatory protein lipid transfer domain)、HD-SAD(homeodomain-START associated domain)和MEKHLA(Met-Glu-Lys-His-Leu-Ala)結(jié)構(gòu)域[19]，該亞家族具有抑制轉(zhuǎn)錄的作用，主要參與植物的胚胎發(fā)育[20]、分生組織形成[21]、維管發(fā)育[22]等；HD-ZipⅣ亞家族含有4個(gè)與HD-ZipⅢ亞家族相同的保守結(jié)構(gòu)域，HD、Zip、START和HD-SAD結(jié)構(gòu)域，但該亞家族蛋白也有其特點(diǎn)[23]，該亞家族基因主要參與表皮細(xì)胞的發(fā)育[24]、物質(zhì)積累及運(yùn)輸[25]、抵抗生物脅迫以及非生物脅迫過程[26]中起重要作用。

白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)具有耐寒性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、適應(yīng)性強(qiáng)、材質(zhì)優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)，是我國(guó)東北地區(qū)具有重要應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展?jié)摿Φ臉浞N之一。在我國(guó)愈來愈多的土地大面積鹽漬化等國(guó)情條件下，白樺速生、抗逆等優(yōu)良品種的缺乏已成為制約白樺木材生產(chǎn)的嚴(yán)重問題。為了獲得提高白樺耐鹽性的相關(guān)基因并深入研究它們調(diào)控的分子機(jī)理，我們對(duì)鹽脅迫下白樺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和白樺全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，從中挑選出在白樺中尚無研究的HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族基因成員，對(duì)這些基因進(jìn)行了生物信息學(xué)特征以及應(yīng)答鹽脅迫的表達(dá)特征分析，為進(jìn)一步深入研究該基因功能奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 鹽脅迫處理白樺幼苗

白樺組培苗移栽到混合培養(yǎng)基質(zhì)中，挑選苗齡八周且長(zhǎng)勢(shì)基本一致的白樺幼苗作為本研究材料，用200 mmol·L-1NaCl溶液分別脅迫處理0、6、12、24和48 h后收根、莖、葉樣品，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍，提取樣品RNA，委托生物公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，最后利用qRT-PCR對(duì)RNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2 白樺HD-Zip基因家族成員的鑒定及其編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

從TAIR(http://www.arabidopsis.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中查找并下載擬南芥HD-Zip基因家族成員的蛋白序列，作為鑒定白樺HD-Zip的請(qǐng)求序列，采用BLASTP程序檢索(E值設(shè)為1-e10)目前已完成的白樺全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(未發(fā)表)，得到靶序列。將這些候選靶序列在pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行結(jié)構(gòu)域檢驗(yàn)。采用BioEdit軟件對(duì)所獲得的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多重序列比對(duì)分析。

將獲得的HD-Zip基因的氨基酸序列放入ExPASy站點(diǎn)中的ProtParam(http://web/expasy/org/protparam/)在線工具預(yù)測(cè)分析，Compute pI/Mw獲得蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)等理化屬性；對(duì)白樺HD-Zip基因家族成員蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)應(yīng)用在線工具PBIL(https://npsa-prabi．ibcp．fr/)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；利用MEGA7.0軟件，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用在線工具M(jìn)EME(http://meme-suite.org/)對(duì)所獲得的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，MEME鑒定的所有結(jié)構(gòu)域均在SMART和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索。

1.3 熒光定量PCR(qRT-PCR)

提取樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)基因的序列，分別設(shè)計(jì)定量引物(表1)，參考SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說明書設(shè)置qRT-PCR反應(yīng)體系。內(nèi)參基因?yàn)锽pTubulin(GenBank登錄號(hào):FG067376)。每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，采用2-△△Ct相對(duì)定量法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 白樺HD-Zip基因家族的鑒定和分類

利用擬南芥的HD-Zip基因， 采用BLASTP程序在目前已完成的白樺基因組庫(kù)中進(jìn)行序列相似性搜索，獲得35條候選序列，并利用HD、Zip結(jié)構(gòu)域進(jìn)行驗(yàn)證。參考擬南芥HD-Zip基因家族的分類以及與擬南芥48個(gè)基因家族成員序列比對(duì)的結(jié)果，將白樺HD-Zip基因家族分成四個(gè)亞家族，其中HD-ZipⅠ中有10個(gè)，HD-ZipⅡ有11個(gè)，HD-Zip Ⅲ中有4個(gè)，HD-Zip Ⅳ有10個(gè)成員。

表1 qRT-PCR引物序列

通過在線網(wǎng)站MEME分析獲得了白樺HD-Zip家族成員的15個(gè)保守序列(表2，圖1)，對(duì)其中的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)合該家族四個(gè)亞家族不同的結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果顯示，高度保守的HD結(jié)構(gòu)和LZ結(jié)構(gòu)域是由保守序列2、1和6保守結(jié)構(gòu)域編碼的；保守結(jié)構(gòu)域12與編碼HD-ZipⅡ亞家族的CPSCG保守結(jié)構(gòu)域相關(guān)；3、5、9、10、和13與START和HD-SAD結(jié)構(gòu)域編碼有關(guān)，11、14和15可能與編碼HD-ZipⅢ亞家族特有的MEKHLA結(jié)構(gòu)域相關(guān)的，4、7和8是HD-ZipⅣ亞家族特有的保守結(jié)構(gòu)域。

圖1 白樺HD-Zip基因家族的預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.1 Predicted conserved motif and phylogenetic analysis of HD-Zip genes in B.platyphylla

Table2TheconservedaminoacidsequenceofHD-ZipproteinfromB.platyphylla

基序編號(hào)Code長(zhǎng)度Length保守氨基酸序列Conserved amino acid sequence129ZLGLEPRQVKVWFQNRRARTKTKQEEVDY229KKKLRLTKEQIQALERSFKECPKLEPKQK341GMAGNRNGTJQLMYAELQVPSPLVPTREFYFLRYCKQLEDG450TSVWLPVSPQRVFDFLRDERLRSZWDILSNGGPVQEMAHIANGQDPGNCV529SFVRCRRLPSGCLIQDMPNGYSKVTWVEH650ESLRDENRRLQKEVQELRALK21750NSSQSNMLILQESCTDSSGSLVVYAPVDIVAMNLVMSGGDPSYVALLPSG841SRETGVVIMNSISLVEILMDVNQWAELFPCIVSRAKTIEVJ930ELDKWSVHELYRPLVESGLAFGAKRWVATL1030KSLLKLAQRMVRGFCAAVSASTDHGWTTLS1150FLSKATGTAVDWVQMPGMKPGPDSIGIVAISHGCSGVAARACGLVGLEPT1250LGSSSPLYIQLPKAATLGMCPACDKIVKATEGKNAAVLDVVGRRNKKLQI1329GGSLLTVAFQILVDSSPTAKLALESVZTV1450PVFTFANQAGLDMLETTLVALQDITLDKIFDDNGRKTLCSEFPKIMQQGF1549GGVLCAKASMLLQNVPPAILLRFLREHRSEWADYNIDAYSAAAJKAGPY

2.2 白樺HD-Zip基因家族的生物信息學(xué)分析

根據(jù)白樺基因組注釋，發(fā)現(xiàn)白樺HD-Zip基因家族成員在白樺染色體上的分布不均勻，在第6、1、8和11染色體上較多，分別為5、4、4和4條，在第4、14、3、5、10和12染色體上分布較少，分別只有3、3、2、2、2和2條，其他染色體上都只有1條，第9條染色體上沒有該家族的基因。

通過對(duì)白樺HD-Zip基因家族成員的序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，白樺HD-Zip基因的編碼的蛋白質(zhì)氨基酸長(zhǎng)度范圍在195～1 100個(gè)氨基酸殘基，分子量在22 215.30～120 849.4 Da范圍。各亞家族蛋白之間氨基酸長(zhǎng)度相差很大，其中HD-ZipⅠ和HD-ZipⅡ在100～400 aa，而HD-Zip Ⅲ和HD-Zip Ⅳ在600～1 100 aa。各亞家族氨基酸長(zhǎng)度不同是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)不同，HD-Zip Ⅲ和HD-Zip Ⅳ亞家族的結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，因而這兩個(gè)亞家族的基因較長(zhǎng)。等電點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，除BPChr08G31889為中性外，有12個(gè)蛋白的等電點(diǎn)在8.00以上，其他都在7.00以下，呈偏酸性。不穩(wěn)定指數(shù)分析顯示，各成員編碼蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)幾乎都在40以上，為不穩(wěn)定蛋白。疏水性分析表明，疏水平均系數(shù)都為負(fù)值，因此所有白樺HD-Zip蛋白為親水性蛋白。

通過對(duì)各成員二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可知，白樺HD-Zip家族成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸連和無規(guī)則卷曲四部分組成，α螺旋和無規(guī)則卷曲是該家族蛋白的主要組成部分。利用Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)對(duì)白樺HD-Zip基因家族的蛋白質(zhì)成員進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析，除了HD-Zip Ⅲ亞家族的BPChr10G05966，HD-Zip Ⅳ亞家族的BPChr03G10886和BPChr08G07648定位于細(xì)胞質(zhì)，HD-Zip Ⅳ亞家族的BPChr04G02674定位于線粒體之外，其他蛋白均定位于細(xì)胞核，表明HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。

2.3 白樺HD-Zip基因應(yīng)答鹽脅迫分析

通過分析白樺鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出7個(gè)HD-Zip家族差異表達(dá)基因，分別為MH381401、MH381502、MH381603、MH381704、MH381805、MH381906和MH382007，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的FPKM值，進(jìn)一步分析這些基因響應(yīng)NaCl脅迫時(shí)的表達(dá)情況，可以發(fā)現(xiàn)MH381401和MH381603基因脅迫處理后表達(dá)量略微下調(diào)；而MH381502、MH381704和MH381906則是表達(dá)量略微上調(diào)；MH381805基因除了在脅迫處理6 h時(shí)有略微的下調(diào)之外，其他時(shí)間點(diǎn)均是顯著上調(diào)表達(dá)，并且在脅迫處理48 h是對(duì)照的16.11倍；MH382007基因在脅迫處理后表達(dá)量顯著上調(diào)，在處理了6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到對(duì)照的70.68倍(圖2)。另外，根據(jù)表3分析發(fā)現(xiàn)，7個(gè)差異表達(dá)的基因中的MH381401和MH381805屬于HD-ZipⅡ亞家族，其他5個(gè)屬于HD-ZipⅠ亞家族。

圖2 轉(zhuǎn)錄組中HD-Zip家族7個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)模式Fig.2 Expression analysis from HD-Zip family gene of seven DEGs by transcriptomic analysis

基因編號(hào)Code類型Type染色體Chromosome氨基酸數(shù)量Number of amino acids分子量Molecular weight等電點(diǎn)Theoretical PI不穩(wěn)定指數(shù)Instability index脂肪系數(shù)Aliphatic index疏水性平均系數(shù)Grand average of hydropathicity二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Secondary structure prediction(%)α-螺旋Alpha belix延伸鏈Extended strandB轉(zhuǎn)角Beta Corner無規(guī)則鏈Random coil亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Subcellular localization predictionBPChr12G11484Ⅰ1270679555.146.3344.4586.74-0.31741.6415.868.5033.99細(xì)胞核NucleusBPChr07G26403Ⅰ732336227.475.1266.4170.06-0.67234.679.603.1052.63細(xì)胞核NucleusBPChr08G01281Ⅰ830634510.184.7953.7965.29-0.83031.0510.782.2955.88細(xì)胞核NucleusBPChr04G03645Ⅰ432937048.564.6659.3767.84-0.77130.0912.462.4355.02細(xì)胞核NucleusMH381906Ⅰ1128732683.776.6058.1967.00-0.79130.666.621.7460.98細(xì)胞核NucleusBPChr08G31889Ⅰ824327616.657.6953.2959.01-1.06538.683.703.7053.91細(xì)胞核NucleusMH382007Ⅰ623827113.345.4246.3265.63-0.83949.165.041.6844.12細(xì)胞核NucleusMH381704Ⅰ219522222.946.2566.4072.56-0.81041.546.672.5649.23細(xì)胞核NucleusBPChr14G27919Ⅰ1422225726.076.6162.6563.24-0.86337.3910.812.7049.10細(xì)胞核NucleusMH381502Ⅰ421324709.446.1660.6759.48-1.07451.646.576.1035.68細(xì)胞核NucleusBPChr08G20441Ⅱ820723413.659.1373.3262.66-0.83436.238.701.4553.26細(xì)胞核NucleusBPunChr33111ⅡUnknon19722215.309.2140.0876.24-0.84839.5913.202.0345.18細(xì)胞核NucleusBPChr01G13738Ⅱ119722714.879.6047.4068.83-1.03937.0612.693.0547.21細(xì)胞核NucleusBPChr01G13608Ⅱ122726054.598.7055.4972.20-0.91432.6012.783.5251.10細(xì)胞核NucleusMH381805Ⅱ122826096.508.0943.9073.16-0.84431.5814.041.7552.63細(xì)胞核NucleusMH381401Ⅱ1225728793.568.5165.2169.49-0.75334.2411.283.1151.36細(xì)胞核NucleusBPChr05G22459Ⅱ528231275.438.5257.8470.99-0.59231.5615.604.2648.58細(xì)胞核NucleusBPChr14G12954Ⅱ1433837305.628.6958.9059.85-0.78429.5915.682.6652.07細(xì)胞核NucleusBPChr03G10966Ⅱ328531914.019.1472.6067.05-0.77431.5813.682.1152.63細(xì)胞核NucleusBPChr13G24610Ⅱ1333637115.908.4568.2170.80-0.68230.3615.1810.7143.75細(xì)胞核NucleusBPChr06G30202Ⅱ633637115.908.4568.2170.80-0.68230.3615.1810.7143.75細(xì)胞核NucleusBPChr06G21476Ⅲ684192602.106.0649.0786.55-0.14540.3114.514.8840.31細(xì)胞核NucleusBPChr01G05204Ⅲ183391293.396.2349.3449.34-0.13443.2213.575.1638.06細(xì)胞核NucleusBPChr10G05966Ⅲ101100120849.436.1543.5786.09-0.08941.2717.097.5534.09細(xì)胞質(zhì)CytoplasmBPChr10G24042Ⅲ1084391824.555.9348.7487.40-0.09040.5713.884.2741.28細(xì)胞核NucleusBPChr03G10886Ⅳ355763239.635.1251.6290.66-0.24839.5016.883.7739.86細(xì)胞質(zhì)CytoplasmBPChr04G02674Ⅳ469476480.445.5249.3186.07-0.11533.7215.565.4845.24線粒體MitochondrionBPChr05G17507Ⅳ577885700.875.3056.3579.00-0.33432.1314.013.9849.87細(xì)胞核NucleusBPChr11G18694Ⅳ1167374775.446.3445.6785.47-0.28535.2216.054.9043.83細(xì)胞核NucleusBPChr11G06804Ⅳ1187797563.778.2850.8587.59-0.17435.9216.195.3642.53細(xì)胞核NucleusBPChr06G08066Ⅳ675683485.526.0347.3475.21-0.45534.3913.763.9747.88細(xì)胞核NucleusBPChr08G07648Ⅳ877184734.246.0648.4184.47-0.23033.7214.272.8549.16細(xì)胞質(zhì)CytoplasmBPChr06G02186Ⅳ681988765.756.0647.6181.81-0.26133.2114.163.4249.21細(xì)胞核NucleusBPChr11G28673Ⅳ1175482129.935.8639.9779.54-0.32125.5413.663.3247.48細(xì)胞核NucleusBPChr14G27036Ⅳ1472880464.326.0446.5782.35-0.33036.8114.153.7145.33細(xì)胞核Nucleus

通過qRT-PCR分析結(jié)果表明，7個(gè)基因在不同脅迫時(shí)間下的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本吻合，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性和和真實(shí)性，同時(shí)，也為以后研究白樺中該家族基因的表達(dá)模式提供了很好的依據(jù)。

2.4 HD-Zip家族中差異表達(dá)基因在白樺不同組織中的表達(dá)分析

通過qRT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，7個(gè)基因在根、莖和葉組織中均有表達(dá)，其中在莖和根中的表達(dá)量相對(duì)較高，在葉中的表達(dá)量相對(duì)較低，如圖4所示，表明這些基因響應(yīng)鹽脅迫的表達(dá)沒有組織特異性。

圖3 qRT-PCR驗(yàn)證7個(gè)白樺HD-Zip差異表達(dá)基因的表達(dá)模式Fig.3 Expression analysis from HD-Zip family gene of seven DEGs by qRT-PCR

圖4 白樺7個(gè)HD-Zip差異表達(dá)基因在不同組織中的表達(dá)模式Fig.4 Expression patterns in different tissues of seven HD-Zip genes from B.platyphylla

3 討論與分析

3.1 白樺全基因組中HD-Zip基因家族的分析

目前，在一些植物中已經(jīng)開展了全基因組范圍內(nèi)的HD-Zip基因家族的鑒定，如擬南芥中鑒定出48個(gè)HD-Zip基因[27]，水稻33個(gè)[28]，玉米55個(gè)[29]，楊樹63個(gè)[30]，小麥46個(gè)[31]，棉花61個(gè)[32]。近年來，在大豆[33]、小麥[31]、玉米[34]、木薯[35]等植物中把全基因組水平的HD-Zip基因家族鑒定與高鹽、干旱、冷害或ABA等非生物脅迫下的基因表達(dá)模式研究相結(jié)合，對(duì)HD-Zip基因家族的調(diào)控植物應(yīng)答非生物脅迫應(yīng)答的功能有了一定的了解。但白樺HD-Zip基因家族尚未報(bào)道。本研究利用擬南芥HD-Zip基因家族序列作為請(qǐng)求序列鑒定出35個(gè)具有完整結(jié)構(gòu)域的HD-Zip基因，家族成員數(shù)量較目前已知的其他物種少。這可能是由于白樺全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因注釋工作尚未完成。我們查找到43條包含HD結(jié)構(gòu)域的候選序列，其中有8條序列較短。除此，系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)白樺HD-Zip基因與林木模式植物楊樹以及其他草本模式植物的同源性不高，種間差異較大。因此，不能預(yù)測(cè)其完整的氨基酸序列。

本文利用序列比對(duì)鑒定的白樺HD-Zip基因，在13條染色體上分布不均勻，可能與進(jìn)化過程中基因的功能特征有關(guān)。HD-Zip基因編碼的蛋白氨基酸數(shù)量和分子量的大小與各亞家族的結(jié)構(gòu)基本符合；HD-ZipⅠ、HD-Zip Ⅲ和HD-Zip Ⅳ蛋白質(zhì)等電點(diǎn)幾乎都是偏酸性的，而HD-ZipⅡ亞家族的都是偏堿性，主要由于這些蛋白含有許多亮氨酸在內(nèi)的堿性氨基酸，這可能與形成亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，從而介導(dǎo)蛋白二聚體的形成密切相關(guān)；不穩(wěn)定系數(shù)表明該家族蛋白都是不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)都在49.34以上，而且大部分都是親水性極強(qiáng)的蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果中α-螺旋和無規(guī)則卷曲所占的比重最大，這些性質(zhì)可能都與該家族蛋白的功能有關(guān)，本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究該基因家族的功能提供參考。

3.2 鹽脅迫下差異表達(dá)HD-Zip基因的分析

目前，對(duì)HD-Zip蛋白的研究表明,HD-ZipⅠ和Ⅱ亞家族基因的表達(dá)能夠被高鹽、干旱、ABA等脅迫的誘導(dǎo)，一些基因能夠提高植物耐逆性[36]，如水稻中HD-ZipⅠ亞家族OsHOX24基因在持續(xù)干旱的脅迫下上調(diào)顯著，而且該基因的啟動(dòng)子融合OsNAC基因過表達(dá)水稻不僅提高了水稻的抗旱性，還增強(qiáng)了水稻的耐鹽性，而且還不會(huì)給水稻的生長(zhǎng)發(fā)育帶來負(fù)面影響[37]；苜蓿中HD-ZipⅡ亞家族的MTHB1基因在鹽脅迫下能夠提高植物的耐鹽能力[38]；向日葵中的HaHB4基因與擬南芥中的AtHB7和AtHB12序列相似性很高，屬于HD-ZipⅠ亞家族的成員，都能響應(yīng)植物的高鹽、干旱及ABA等非生物脅迫[39]。通過高鹽脅迫白樺轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果獲得的7個(gè)差異表達(dá)的HD-Zip家族基因都屬于HD-ZipⅠ或Ⅱ亞家族成員，表明這些基因參與白樺對(duì)高鹽脅迫的響應(yīng)。本研究是基于現(xiàn)有的白樺基因組和鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，開展白樺HD-Zip基因家族的鑒定與分析工作，為進(jìn)一步研究該基因家族在提高植物耐鹽性的功能奠定了理論基礎(chǔ)。