李文靜 孫艷香

(1.廊坊師范學院生命科學學院，廊坊 065000； 2.廊坊師范學院生命科學學院遺傳與育種研究所，廊坊 065000)

胚乳是谷類作物淀粉和蛋白的儲藏器官，為人類提供了豐富的能量和優(yōu)質(zhì)的蛋白，因此通過基因工程手段改良胚乳組分和品質(zhì)具有重要意義[1]。不僅如此，相較于其他表達系統(tǒng)，以胚乳作為生物反應(yīng)器具有產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、易規(guī)?；?、安全性高、遠離動物病菌、綠色環(huán)保等優(yōu)點[2～3]。然而目前僅有少數(shù)啟動子能夠驅(qū)動外源蛋白在胚乳中穩(wěn)定高效表達[4]。谷蛋白占水稻種子貯藏蛋白的70%，主要在胚乳中表達。因此谷蛋白基因啟動子是分離克隆強的胚乳特異性表達啟動子的優(yōu)質(zhì)材料，對于控制外源基因在種子中特異表達具有重要理論和實踐意義。

啟動子在決定基因的時空特異性表達方面具有重要的作用，主要包括組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導型啟動子三種類型[5]。近年來，一些強的組成型啟動子，例如煙草花葉病毒35S(CaMV35S)啟動子和玉米Ubiquitin啟動子被廣泛應(yīng)用于植物基因工程領(lǐng)域[6～7]。但通常不能滿足特定基因在特定組織的表達，而且目的基因持續(xù)高水平在所有組織中表達有可能對寄主植物造成傷害[8～9]。用強的胚乳特異性表達啟動子驅(qū)動外源基因在水稻胚乳中特異表達，不僅可以實現(xiàn)目標蛋白的持續(xù)穩(wěn)定表達，也可大大緩解由于大量異源蛋白在所有組織中的存在對植物造成的不可逆?zhèn)10～11]。目前已經(jīng)從水稻、玉米、小麥等作物中分離克隆到一些胚乳特異性表達啟動子[10,12～15]，但這些啟動子在植物遺傳系統(tǒng)中的應(yīng)用尚少有報道[16]。農(nóng)作物中許多重要性狀，例如淀粉含量和次級代謝產(chǎn)物等都是受多基因控制，單個基因轉(zhuǎn)化對此類性狀改良效果甚微。近年來，同時構(gòu)建幾個基因到一個表達載體上的多基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)逐步取代了傳統(tǒng)的重復轉(zhuǎn)化和雜交手段用以改良胚乳營養(yǎng)成分[17～19]。在這種多基因表達系統(tǒng)中，每一種基因都需要特異的啟動子來驅(qū)動表達，以避免由于轉(zhuǎn)入序列同源性過高而引起轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象[20]。此外，啟動子長度應(yīng)該盡量縮短，避免長片段的斷裂以及構(gòu)建時無合適酶切位點的現(xiàn)象。因此分離并鑒定水稻胚乳特異性高表達的啟動子是開展基因工程改良稻米品質(zhì)的重要基礎(chǔ)。前人研究多集中于啟動子中順式作用元件的類型、位置等對啟動子的表達效率、表達模式產(chǎn)生的影響，而對胚乳特異性表達的啟動子順式作用元件的分析鮮有報道。

本研究以水稻品種kitaake為材料，克隆了GluC基因的啟動子pGluC，分析其順式作用元件，將一系列5′端缺失的啟動子與GUS基因融合構(gòu)建表達載體，轉(zhuǎn)化水稻獲得轉(zhuǎn)基因株系。通過GUS組織化學染色和GUS活性分析明確水稻谷蛋白GluC基因啟動子的表達模式和活性區(qū)域，為在水稻和其他谷類作物中實現(xiàn)多基因轉(zhuǎn)化產(chǎn)生高附加值重組蛋白提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

水稻(OryzasativaL.)為日本特早熟粳稻品種kitaake、植物表達載體pGPTV-GUS、大腸桿菌(E.coli)TOP10、根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105由廊坊師范學院遺傳與育種研究所保存。

基因組DNA提取試劑盒(Aidlab)、限制性內(nèi)切酶HindⅢ、SalⅠ和LA Taq均購自TaKaRa生物有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品。MS鹽、6-芐氨基嘌呤(6-BA)、α-萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，利福平(Rif)抗生素、卡那(Kan)抗生素、羧芐青霉素、潮霉素等試劑，LB培養(yǎng)基、YEB培養(yǎng)基均購置于上海生工生物工程公司。

表1 本研究所用引物序列

注：下劃線分別為HindⅢ(AAGCTT)和SalⅠ(GTCGAC)的酶切位點序列。

Note:The restriction enzymeHindⅢ(AAGCTT) andSalⅠ(GTCGAC) are indicated with underlines.

1.2 GluC啟動子的克隆及序列分析

利用試劑盒提取水稻kitaake三葉期葉片基因組DNA，根據(jù)NCBI公布信息，應(yīng)用DNAMAN軟件設(shè)計上下游引物，采用常規(guī)PCR方法擴增GluC基因5′側(cè)翼序列，PCR條件為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 120 s，35個循環(huán)；72℃，10 min。擴增產(chǎn)物連接到pMD-18T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10，挑取單菌落經(jīng)PCR鑒定后送至上海美吉生物工程公司測序。測序結(jié)果與已知序列比對后，利用啟動子在線分析網(wǎng)站PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)[21]和PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/)[22]分析及預測啟動子內(nèi)部含有的順式作用元件。

1.3 GluC啟動子植物表達載體的構(gòu)建

以全長GluC片段為模板，分別對功能元件所在的位置進行5′端缺失，分別設(shè)計GluC-F1、GluC-F2、GluC-F3、GluC-F4、GluC-F5、GluC-F6、GluC-F7七個正向引物和GluC-R配對，進行PCR擴增。F、R引物上分別帶有HindⅢ和SalⅠ酶切位點，PCR擴增獲得1 911、1 611、1 311、999、451、203、102 bp七個片段。將PCR片段通過TA克隆插入到pMD18-T載體中，分別命名為P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7。HindⅢ和SalⅠ對以上載體進行雙酶切鑒定，酶切驗證正確的質(zhì)粒送去測序。將測序正確的T載體以及pGPTV-GUS載體分別用HindⅢ和SalⅠ雙酶切，回收酶切片段，連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，得到的陽性克隆分別命名為P1-GUS、P2-GUS、P3-GUS、P4-GUS、P5-GUS、P6-GUS、P7-GUS(圖1)。

圖1 pGluC-deletion載體構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of the expression vector pGluC-deletion construction

1.4 水稻的遺傳轉(zhuǎn)化及陽性植株檢測

熱激法將重組植物表達載體導入農(nóng)桿菌EHA105中，水稻愈傷組織培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱，通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化水稻胚性愈傷組織。農(nóng)桿菌和水稻愈傷在28℃共培養(yǎng)3 d，侵染的愈傷在含有45 mg·L-1潮霉素的N6D篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～6周、轉(zhuǎn)移至MS分化培養(yǎng)基上，獲得T0代轉(zhuǎn)基因水稻。提取含8種不同類型啟動子的轉(zhuǎn)基因水稻植株(以非轉(zhuǎn)基因水稻為對照)的葉片基因組DNA，以其為模板，植物表達載體pGPTV-GUS上的GUS基因為目標基因設(shè)計引物(GUS-F，GUS-R)進行PCR擴增，產(chǎn)物大小為472 bp，經(jīng)10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 GUS基因的半定量RT-PCR分析

提取轉(zhuǎn)pGluC啟動子轉(zhuǎn)基因水稻的根、莖、葉及灌漿期種子總RNA，經(jīng)DNaseI消化，用逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以水稻Actin基因為內(nèi)參，RT-PCR方法檢測GUS基因的表達情況。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株的GUS組織化學分析

分別取非轉(zhuǎn)基因水稻、轉(zhuǎn)P1-GUS、P2-GUS、P3-GUS、P4-GUS、P5-GUS、P6-GUS、P7-GUS載體的陽性植株和pGluC啟動子陽性植株，成熟期后分別取根、莖、葉和種子進行GUS染色，具體步驟參照Jefferson等[23]方法進行。將待染色的根、莖、葉材料，剪成0.5 mm的小段，開花后17天的種子縱切成兩半，放入1.5 mL離心管中。每管加入適量X-GluC(50 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH7.0)，20%甲醇，5% DMF，0.5 mg·mL-1X-GluC)反應(yīng)液，37℃染色2 h或者過夜，除去染液。用70%酒精脫色3次，至陰性對照材料呈白色，體視鏡掃描照像。

1.7 GUS活性測定分析

GUS活性的熒光檢測方法參照Jefferson[23]。取莖、葉及轉(zhuǎn)基因水稻開花后17天(17 DAF)水稻種子，分別放于1.5 mL離心管中，在200 μL GUS提取液(50 mmol·L-1NaHPO4(pH7.0)，10 mmol·L-12-Me，10 mmol·L-1Na2-EDTA，0.1% SDS，0.1% Triton X-100)中研磨勻漿。12 000 r·min-1離心10分鐘，上清液即為GUS粗蛋白提取液。以4-MU配制標準曲線，4-MUG作為底物進行酶促反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在激發(fā)光365 nm，發(fā)射光455 nm，狹縫10 nm條件下測定各樣品的熒光值，Bradford法進行GUS蛋白定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 pGluC在胚乳中的特異性表達

以水稻kitaake基因組DNA為模板，GluC-F、GluC-R為引物進行PCR擴增，得到2 332 bp的GluC啟動子片段(圖2A)，命名為pGluC。將擴增片段及植物表達載體pGPTV-GUS分別用HindⅢ和SalⅠ雙酶切后連接，經(jīng)酶切檢測和測序驗證獲得正確的重組載體pGluC-GUS。通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)基因植株(圖2B)。RT-PCR分析和GUS組織化學染色顯示pGluC-GUS在水稻根、莖、葉中始終檢測不到表達，僅在水稻種子胚乳中表達(圖2C)，結(jié)果表明pGluC為胚乳特異性表達啟動子。

2.2 GluC啟動子順式作用元件分析及功能預測

通過啟動子順式作用元件分析網(wǎng)站PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/)分析啟動子pGluC內(nèi)包含的順式作用元件。結(jié)果顯示-2331～+1片段是GluC基因的5′端序列，TATA box位于-68～-62(起始密碼子為+1)。全長pGluC啟動子內(nèi)部含有多種啟動子表達所必需的順式作用元件(圖3，表2)，除基本的調(diào)控元件TATA-box和CAAT-box外，還包含多個胚乳特異性表達元件，如Skn-1 motif和ACGT motif，與2.1結(jié)果pGluC是一個胚乳特異性啟動子相符合。

圖2 pGluC轉(zhuǎn)基因植株獲得及表達模式分析 A.水稻GluC啟動子pGluC的克??；B.轉(zhuǎn)基因植株獲得；C.pGluC組織表達模式分析Fig.2 Production of pGluC transgenic plants and analysis of the expression pattern A.Amplified fragment of GluC gene pGluC in rice; B.Production of transgenic rice plants; C.Expression pattern of the pGluC promoter

元件Element序列及數(shù)量Sequence and number位置Location(bp)功能FunctionA-boxCCGTCC,1-2089～-2084順式調(diào)控元件cis-acting regulatory elementACGT-boxACGT,3-1878～-1875,-534～-531,-427～-424胚乳特異表達所需的順式作用元件cis-acting regulatory element required for endosperm expressionARETGGTTT,1-1744～-1739厭氧誘導必須順式作用元件cis-acting regulatory element essential for the anaerobic inductionCAAT-boxCAAT,15-2120～-2177,-1995～-1991,-1788～-1784,-1673～-1670,-1473～-1468,-1395～-1392,-1263～-1259,-1061～-1057,-941～-937,-787～-783,-659～-655,-546～-543,-455～-452,-423～-419,-234～-231啟動子和增強子內(nèi)部通用順式作用元件Common cis-acting element in promoter and enhancer regionsCATT-motifGCATTC,1-341～336部分光響應(yīng)元件Part of a light responsive elementCiradianCAATGGTATC,1-269～-260生物節(jié)律調(diào)控cis-acting regulatory element involved in circadian controlI-boxATCTTATGCT,1-518～-519部分光響應(yīng)元件Part of a light responsive elementMBSCAACTG,1-1697～-1692與干旱誘導相關(guān)的MYB結(jié)合位點MYB binding site involved in drought-inducibilityMREAACCTAA,1-639～-633與光反應(yīng)相關(guān)的MYB結(jié)合位點MYB binding site involved in light responsivenessSkn-1 motifGTCAT,3-1335～-1331,-562～-558,-445～-441胚乳特異表達所需的順式作用元件cis-acting regulatory element required for endosperm expressionTATA-boxTATATAA,1-68～-62核心啟動子元件Core promoter element

注：GluC的起始密碼子ATG中A位置標記為+1，第三列代表距離起始密碼子ATG上游的位置，用負號(-)標記。

Note:Location(bp) of A in the GluC initiation codon ATG is marked +1,and the third column indicates location relative to upstream of GluC initiation codon ATG,denoted with minus(-).

圖3 啟動子pGluC序列及預測的順式作用元件 啟動子不同元件被標注，元件名稱在標記上方給出。箭頭代表啟動子序列被截短的位置。Fig.3 Sequence and predicted cis-acting elements of pGluC Various elements of the promoter are shaded and their names are given on the top. The sites where the promoter sequence were shortened are marked by arrows.

2.3 缺失載體構(gòu)建及水稻遺傳轉(zhuǎn)化

基于對啟動子pGluC的生物信息學分析結(jié)果，結(jié)合已知順式作用元件在啟動子內(nèi)的分布和功能預測，轉(zhuǎn)錄起始位點上游-1 911、-1 611、-1 311、-999、-451、-203、-102 bp七個區(qū)域作為候選啟動子，構(gòu)建了7種5′端缺失載體。以pGluC-GUS重組質(zhì)粒為模板，通過設(shè)計對應(yīng)引物進行PCR擴增。將這7個擴增產(chǎn)物通過TA克隆插入到pMD 18-T載體中，分別命名為P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7。對以上T載體進行雙酶切鑒定(圖4A)，酶切驗證正確的質(zhì)粒送去測序。將測序正確的T載體以及pGPTV-GUS載體雙酶切后進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，提取質(zhì)粒雙酶切驗證獲得正確的重組質(zhì)粒(圖4B)。將這些陽性克隆分別命名為P1-GUS、P2-GUS、P3-GUS、P4-GUS、P5-GUS、P6-GUS、P7-GUS。重組質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化水稻，獲得轉(zhuǎn)基因植株。對轉(zhuǎn)基因植株進行潮霉素篩選，之后使用GUS-F和GUS-R引物進行PCR擴增，呈陽性的T0代單株(圖5)，用于后續(xù)實驗。

圖4 啟動子5′端缺失T載體和 重組載體的酶切鑒定 A：M. DL5000 Marker; 1. P1/HindⅢ+SalⅠ; 2. P2/HindⅢ+SalⅠ; 3. P3/HindⅢ+SalⅠ; 4. P4/HindⅢ+SalⅠ; 5. P5/HindⅢ+SalⅠ; 6. P6/HindⅢ+SalⅠ; 7. P7/HindⅢ+SalⅠ B：M. DL5000 Marker; 1. P1-GUS/HindⅢ+SalⅠ; 2. P2-GUS/HindⅢ+SalⅠ; 3. P3-GUS/HindⅢ+SalⅠ; 4. P4-GUS/HindⅢ+SalⅠ; 5. P5-GUS/HindⅢ+SalⅠ; 6. P6-GUS/HindⅢ+SalⅠ; 7. P7-GUS/HindⅢ+SalⅠFig.4 T and recombinant vector identification of 5′ deletion of promoter fragements

圖5 T0代轉(zhuǎn)基因水稻的PCR檢測 M. DL5000 Marker；1.陽性對照；2.陰性對照，非轉(zhuǎn)基因水稻；3～12.不同轉(zhuǎn)基因的水稻植株Fig.5 PCR analysis of T0 transgenic rice plants M. DL5000 Marker; 1. CK+; 2. CK-,non-transformed rice; 3-12. Different transgenic rice plants

圖6 截短的pGluC啟動子GUS表達模式分析 a.根；b.莖；c.葉；d.種子Fig.6 The GUS staining results on the transformants of deleted pGluC promoter a.Root; b.Stem; c.Leaf; d.Seed

2.4 不同啟動子組織表達特異性分析

為了檢測GluC啟動子的時空表達特異性，分別取非轉(zhuǎn)基因水稻和T0代轉(zhuǎn)基因植株的根、莖、葉、種子進行GUS組織化學染色。結(jié)果顯示非轉(zhuǎn)基因水稻(kitaake)的根、莖、葉、種子無任何藍色斑點出現(xiàn)。pGluC啟動子驅(qū)動GUS在水稻種子胚乳中有很強的表達，在根、莖、葉片中不表達。P1-GUS，P2-GUS，P3-GUS與pGluC-GUS表達模式一致，僅在水稻種子胚乳中表達。而P4-GUS，P5-GUS，P6-GUS，P7-GUS除在胚乳中表達外，根、莖、葉等營養(yǎng)器官中GUS染色也呈藍色。P4-GUS與P5-GUS在莖、葉子中GUS有了不同程度表達。P6-GUS與P7-GUS在轉(zhuǎn)基因水稻植株根、莖、葉中均有表達。但P7-GUS在各個部位表達強度均較弱，且種子中表達水平明顯降低(圖6)。結(jié)果表明，GluC啟動子內(nèi)部可能含有一些控制pGluC在特定組織中表達的功能性順式作用元件。

2.5 pGluC及截短的啟動子的GUS活性分析

轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)GUS組織化學染色分析后，初步判斷不同長度啟動子驅(qū)動的GUS基因的表達模式，但并不能判斷啟動子活性大小。為了進一步明確啟動子的活性，對攜帶啟動子缺失片段的轉(zhuǎn)基因植株進行GUS活性分析。每個載體測定十個植株，其GUS酶活性是10株植株的平均值。

提取8個載體莖、葉、種子的蛋白，以4-MUG為底物，進行GUS活性的熒光檢測。P1-GUS，P2-GUS，P3-GUS與pGluC-GUS表達模式一致，根、莖、葉中檢測不到GUS信號，而種子中有很強的GUS表達。當啟動子缺失至-999 bp時，莖、葉中也有表達，種子中表達強度與全長啟動子基本沒有區(qū)別。從-999 bp缺失至-451 bp時，種子中表達略微下降，莖中與前者相比表達水平升高，葉中與前者相比表達水平降低。從-451 bp缺失至-203 bp時，種子中GUS表達強度明顯降低，后者僅是前者的20%；莖、葉中表達量增加，均是前者的3.5倍；從-203 bp缺失至-102 bp時，種子中表達強度進一步下降，后者表達量僅是前者的6%；葉中表達量也明顯下降，后者僅是前者的22.2%；莖中則增加，后者是前者的1.39倍(圖7)。以上結(jié)果表明-1 311 bp GluC啟動子，能夠驅(qū)動GUS基因在水稻種子胚乳中高效特異穩(wěn)定表達。-1311～-999 bp區(qū)間可能含有抑制莖和葉中表達的順式作用元件，-999～-451 bp區(qū)間可能含有促進種子和葉子中表達，抑制莖中表達的順式作用元件，-451～-203 bp區(qū)間可能含有促進莖葉以及抑制種子表達的順式作用元件，-203～-102 bp區(qū)間可能含有促進種子、葉子以及抑制莖中特異表達的順式作用元件，ATG上游-999 bp以內(nèi)區(qū)間的ACGT-box和Skn-1 motif具有增強胚乳特異性表達的作用。

圖7 轉(zhuǎn)基因水稻GUS定量分析Fig.7 Quantification of GUS activity in transgenic rice

3 討論

高等植物基因表達受轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平多方面的調(diào)控，外源基因在受體內(nèi)的表達受到拷貝數(shù)、插入位置、啟動子類型等諸多因素的影響，但很大程度上依賴于驅(qū)動外源基因表達的啟動子[24]。啟動子在很大程度上決定了基因的表達部位、表達時期和表達水平。目前，研究啟動子主要通過生物信息學分析和實驗分析兩種方式進行。生物信息學方法分析啟動子序列，可以預測其中的順式作用元件種類、數(shù)目及位置，為進一步研究啟動子的功能奠定基礎(chǔ)。實驗分析主要通過瞬時表達、酵母單雜交[25]、凝膠阻滯[26]和5′端片段缺失分析[27～28]等方法中的一種或幾種混合進行。本研究采用生物信息學分析和不同長度啟動子融合GUS基因穩(wěn)定表達相結(jié)合的方法，研究GluC基因啟動子的重要順式作用元件和表達特性。

報告基因在分析啟動子的組織表達特異性方面具有重要作用，在眾多報告基因中，GUS基因由于其敏感性和簡單易操作性被廣泛應(yīng)用。相較于瞬時轉(zhuǎn)化分析，我們采用農(nóng)桿菌介導的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方式來解析GluC啟動子的功能。盡管使用基因槍介導的瞬時轉(zhuǎn)化方法進行特定植物組織的轉(zhuǎn)化可以驗證某些胚乳特異性表達啟動子的活性[29～30]，但是這些組織特異性啟動子的瞬時表達并不能正確反映其穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的表達模式[31]。有關(guān)胚乳組織的瞬時表達研究可以輔助尋找一段啟動子序列，但是對于內(nèi)源基因在胚乳內(nèi)的表達模式或發(fā)育時期的研究鮮有報道[32]。此外，研究表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)化對于種子特異性表達啟動子的正確調(diào)控是必須的[33]。因此，將GUS報告基因與GluC啟動子融合通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株來研究GluC啟動子的功能更行之有效。

本研究選取轉(zhuǎn)基因植株的根、莖、葉、種子進行GUS組織化學染色和GUS定量分析。前人研究表明，2.3 kBGluC啟動子驅(qū)動GUS在開花后7 d水稻胚乳糊粉層、亞糊粉層表達，隨著開花時間延長，17 d時在整個水稻胚乳表達[13]。因此我們也選取轉(zhuǎn)基因植株開花后17 d種子作為材料。結(jié)果表明，GluC啟動子驅(qū)動GUS在胚乳中高表達，而根、莖、葉中檢測不到GUS信號(圖2C)。啟動子在線分析表明該啟動子除了具有核心順式作用元件CAAT-box和TATA-box外，還含有胚乳特異性表達所必需的ACGT-box和Skn-1 motif。這與GluA-1，GluA-2，GluA-3，GluB-3，GluB-5等谷蛋白基因啟動子通過其內(nèi)部含有的保守的GCN4和AACA元件來介導胚乳特異性表達有所不同[13,34]，說明GluC啟動子可能通過新的調(diào)控方式介導胚乳特異性表達。

為了研究胚乳特異性表達順式作用元件的功能，我們對GluC啟動子進行了5′端缺失分析。我們構(gòu)建了7個缺失啟動子載體，分別轉(zhuǎn)化水稻，通過潮霉素抗性篩選及基因組PCR擴增，獲得轉(zhuǎn)化不同長度啟動子片段的陽性植株。結(jié)果表明，P1-GUS，P2-GUS，P3-GUS與pGluC-GUS表達模式一致，穩(wěn)定的GUS信號僅在水稻種子的胚乳中出現(xiàn)，而根、莖、葉中均檢測不到GUS表達(圖6～7)。當啟動子缺失至-999 bp時，莖、葉中開始出現(xiàn)表達；進一步缺失至-343 bp時，莖、葉、根中GUS均出現(xiàn)不同程度表達(圖6～7)。這與ZmDULL1胚乳特異性表達啟動子漸進缺失后，-343～-1 bp區(qū)間介導的GUS活性與全長啟動子一致，當片段延長到-1 216或-1 676 bp時，啟動子活性反而降低，但是仍能介導胚乳特異性表達結(jié)果不同[35]。說明GluC啟動子內(nèi)部含有促進或者抑制根、莖葉中表達的順式作用元件，以復雜的調(diào)控方式介導胚乳特異性表達。因此繼續(xù)探明GluC啟動子內(nèi)部促進或抑制根莖葉中表達的順式作用元件，將有助于精準揭示其調(diào)控機制。

綜上所述，GluC啟動子內(nèi)部含有胚乳特異性表達元件，驅(qū)動GUS基因在胚乳中穩(wěn)定高效表達。1 311 bpGluC啟動子內(nèi)部含有兩個Skn-1 motif和兩個ACGT-box以及TATAbox(圖3，表2)，足以驅(qū)動胚乳特異性高表達。在植物基因工程中，1 311 bpGluC啟動子可以替代2.3 kBGluC啟動子，更好地被應(yīng)用。此外，我們可以分離出胚乳特異性表達元件，人工組建啟動子，應(yīng)用于分子育種，提高重組蛋白在水稻種子生物反應(yīng)器中的含量。

4 結(jié)論

從水稻品種kitaake基因組DNA中克隆了GluC基因的啟動子pGluC，長度為2 322 bp，該啟動子內(nèi)部含有胚乳特異性表達元件ACGT-box和Skn-1 motif，驅(qū)動GUS基因特異地在水稻種子胚乳中表達，根、莖、葉中未檢測到表達。1 911、1 611、1 311 bpGluC啟動子組織化學表達模式以及表達活性與全長啟動子一致，僅在水稻種子胚乳中表達。在植物基因工程中1 311 bpGluC啟動子操作方便，可以起到替代全長GluC啟動子的作用。本研究結(jié)果為組織特異性表達啟動子的開發(fā)和應(yīng)用提供了依據(jù)。