楊 柯，任 玲

(中國科學院金屬研究所，遼寧 沈陽 110016)

1 前 言

1.1 支架內(nèi)再狹窄及主要影響因素

盡管心血管支架在過去幾十年里取得了顯著的治療效果，但它一直被支架植入后發(fā)生的再狹窄問題所限制[1]。支架內(nèi)再狹窄是指經(jīng)過冠脈介入手術(shù)后，冠狀動脈造影結(jié)果顯示血管內(nèi)徑再次狹窄超過50%以上。相比于早期的球囊血管成形術(shù)，金屬裸支架(bare metal stent，BMS)的出現(xiàn)大大減少了支架內(nèi)再狹窄(in-stent restenosis，ISR)的發(fā)生，使其發(fā)生率減少為20%～40%。為了進一步降低支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生率，人們又開發(fā)出了在金屬支架上包裹藥物涂層的藥物洗脫支架(drug-eluting stent，DES)，將支架內(nèi)再狹窄降低到了5%～10%，但再狹窄發(fā)生率仍未控制在令人滿意的范圍內(nèi)[2,3]。

人體動脈血管的內(nèi)膜主要由內(nèi)皮細胞構(gòu)成，中膜主要由平滑肌細胞構(gòu)成。支架在植入血管的過程中，首先血管內(nèi)膜受到損傷引發(fā)炎癥反應，血小板聚集在支架處易形成血栓，接著平滑肌細胞向該部位遷移和增殖，細胞外基質(zhì)大量生成，這導致了新生內(nèi)膜的產(chǎn)生[4]。支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生主要是血栓形成和新生內(nèi)膜作用的結(jié)果[5]。此外，支架膨脹不良、支架斷裂、過敏反應等多種因素也會影響支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生[6]。目前應對這種現(xiàn)象的治療手段包括再次植入支架、球囊擴張、冠狀動脈斑塊旋切術(shù)等方法，但并沒有最佳的治療方案。

1.2 銅對人體心血管系統(tǒng)的有益作用

200多年前，人們就發(fā)現(xiàn)銅(Cu)可以促進兔子無血管的角膜中新血管的生成[7]。人體缺乏Cu會導致血管膠原和蛋白合成障礙，從而不利于血管的連接。對體內(nèi)缺乏Cu的動物的解剖學結(jié)果表明，這些動物的大動脈出現(xiàn)了裂紋，動脈中有泡狀細胞，心臟肥大，平滑肌細胞增殖和遷移，冠狀動脈有血栓形成[8]。醫(yī)學研究證實，Cu能夠促進內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，而血管形成主要就是依靠內(nèi)皮細胞的增殖和遷移[9]。新血管的生成受到相關的生長因子的調(diào)控，比如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)等。

VEGF是目前發(fā)現(xiàn)能夠促進血管生成的最有效的生長因子，研究的也最為深入。VEGF信號通路在血管生成過程中參與了眾多調(diào)節(jié)過程，有著無可替代的作用。它能顯著促進全身各組織器官中內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和趨化[10]。研究表明，CuSO4通過釋放Cu離子，可激活EGFR/ERK/c-fos傳導通路，提高癌癥細胞中VEGF的表達，并且經(jīng)過CuSO4處理過的癌癥細胞培養(yǎng)液可以促進內(nèi)皮細胞的遷移及血管生成能力[11]。在功能性子宮內(nèi)膜出血的患者體內(nèi)，血清中Cu含量的明顯增加，進而促進了VEGF-A的分泌，導致了子宮內(nèi)膜的生長[12]。由此可以看出，Cu與VEGF的增加有著顯著的關系。

FGF能夠促進成纖維細胞的增長，是強烈的結(jié)締組織細胞促生長因子。FGF有多種異構(gòu)體，其中hFGF-1是以多蛋白復合物的形式釋放到細胞外的，其突觸結(jié)合蛋白的C2A區(qū)域與Cu離子有著很高的親和力，這表明Cu參與了FGF多蛋白復合物的形成[13]。HIF-1α是在缺氧狀態(tài)下血管生成的調(diào)控因子，具有相當廣泛的靶基因譜。在細胞缺氧時，HIF-1α能改變細胞代謝中的氧含量，啟動保護性反應[14]。HIF-1α能促進VEGF的表達，從而促進血管的生成[15]。Cu可以調(diào)節(jié)HIF-1α與低氧反應元件HRE的結(jié)合以及HIF-1轉(zhuǎn)錄復合物的形成，所以HIF-1α的激活需要Cu的參與[16]。此外，Cu在激活HIF-1α后，也能促進它的表達[17]。

人體內(nèi)血管新生往往伴隨著血管舒張。雖然許多因子都具有促進血管舒張的特性，但是最終都要歸根于一氧化氮(NO)的作用。NO通過激活NO合成酶和MAPK信號通路，提高FGF-2的表達，從而觸發(fā)及誘導細胞的增長和分化[18]。NO合成酶一共有3種亞型，包括神經(jīng)型NO合酶、內(nèi)皮型NO合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)及誘導型NO合酶，其中前兩種酶只能在短時間內(nèi)產(chǎn)生少量的NO，后一種則能在數(shù)小時內(nèi)產(chǎn)生大量的NO[19]。eNOS可以合成NO，在內(nèi)皮細胞的遷移、增殖和分化中扮演著必不可少的角色。將小鼠eNOS的基因敲除后發(fā)現(xiàn)，小鼠的傷口愈合速度明顯下降[20]。Demura等測定了Cu2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+這4種金屬二價離子對eNOS活性的影響，發(fā)現(xiàn)只有Cu2+在濃度大于10-6mol/L時才會明顯增加人的肺動脈內(nèi)皮細胞中eNOS的活性[21]。反之，飲食中Cu的缺乏會導致小鼠受NO調(diào)節(jié)的血管舒張功能退化[22]。

以上醫(yī)學研究結(jié)果表明，Cu是人體中必不可少的微量元素，特別是其具有促進血管生成的作用。在正常情況下，它維持人體血管基本的結(jié)構(gòu)和功能。在血管受損傷時，Cu能通過提高VEGF、FGF、HIF-1α等相關因子的表達來促進內(nèi)皮細胞、成纖維細胞的增殖和分化，保護細胞不受缺氧的影響。此外，Cu還能增加血管生成所必需的NO的釋放，以提高損傷部位的愈合速度。所以，Cu對人體冠脈系統(tǒng)的健康起著重要的生物功能性作用。

Cu還參與人體內(nèi)正常細胞的代謝過程，在生物系統(tǒng)中起著獨特的催化作用。Cu是生物體內(nèi)血漿銅藍蛋白、超氧歧化酶、細胞色素C氧化酶、多巴胺β-羥化酶等13種以上酶中的活性成分，在維持生物體內(nèi)的新陳代謝方面起著多種極為重要的生理和生化作用[23]。Cu能促進造血機能，調(diào)節(jié)鐵的吸收和利用，維護骨骼、血管、皮膚和內(nèi)分泌的正常功能，促進骨骼、血管和皮膚膠原的生成。Cu對心血管系統(tǒng)的影響很大，在心肌的收縮與舒張、細胞膜的結(jié)構(gòu)與功能、血壓調(diào)節(jié)、體內(nèi)水鈉平衡以及血液凝固中起著重要作用[24]。人體內(nèi)的細胞色素C及多種金屬酶中都含有微量的Cu元素，這些金屬酶能促進心血管中的基質(zhì)膠原和彈性硬蛋白的合成，對維持心血管的正常結(jié)構(gòu)和良好彈性極為重要。此外，心臟和動脈壁中的銅酶是血管內(nèi)3種主要結(jié)締組織中的重要成分，對冠心病的形成起著重要的抑制作用[25]。然而，Cu在人體中的含量是受到嚴格控制的。正常成年人體內(nèi)含Cu量為100～200 mg，50%～70%的Cu存在于肌肉及骨骼內(nèi)，20%左右存在于肝臟內(nèi)，5%～10%分布于血液內(nèi)，微量存在于含銅的酶類中。Cu在人體內(nèi)不易保留，需經(jīng)常攝入和補充。世界衛(wèi)生組織建議成人每日Cu的上限攝入量為2～3 mg[26]。其調(diào)查顯示，全世界存在較多缺Cu的高危人群。例如，目前只有25%的美國居民日常攝入的Cu量達到了美國國家科學院食品和營養(yǎng)委員會推薦的合適水平。

人體內(nèi)缺Cu不僅容易引發(fā)貧血、心臟肥大、冠心病、關節(jié)炎骨質(zhì)疏松等疾病，還會影響人體的分泌系統(tǒng)和免疫功能。其中，缺Cu對心血管系統(tǒng)的影響最為顯著。有研究表明，Cu缺乏容易導致心房血栓形成、冠狀動脈壞死、冠狀動脈血栓形成、心肌壞死和心室鈣化等疾病[27]。缺Cu還易導致動脈平滑肌的遷移和變性、動脈彈性組織變性和斷裂，以及心室和冠狀動脈瘤的形成[28]。Cu離子不僅能誘導內(nèi)皮生長因子，促進內(nèi)皮細胞增殖，進而加快血管再生過程，而且能阻止動脈平滑肌細胞(VSMC)的過度增殖[9]。由此可見，如果在心血管系統(tǒng)中造成微量Cu元素的持續(xù)釋放，可能會同時起到促進內(nèi)皮細胞生長、抑制動脈平滑肌過度增殖以及降低血栓形成傾向等多方面有益的生物醫(yī)學功能及作用。

Baird等[29]研究表明，銅離子有助于將VSMC內(nèi)的硫醇排出胞外；而缺Cu的細胞硫醇不能排出，在胞內(nèi)可形成超氧化物，這種超氧化物會降低NO的生物活性，使低密度脂蛋白(LDL)被氧化，阻礙VSMC中的乙酰膽堿與組胺之間的反應，從而會導致VSMC的過度增殖并變性，形成泡沫細胞。因此如果在冠脈支架置入血管受損處能夠原位持續(xù)地釋放(補充)微量銅離子，將有望能夠抑制血管受損處的VSMC的增殖和變性，進而降低由VSMC增殖和變性引發(fā)的支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生率。

Johnson等[30]研究表明，銅離子會影響血小板中鈣元素的運動，刺激凝血酶，并影響銅-過氧化物歧化酶的活力，降低血小板中血栓素和脂質(zhì)過氧化氫物的產(chǎn)生，進而抑制血栓的形成。在冠脈支架的植入過程中，血管壁損傷會導致血小板活化，釋放凝血酶，并激活更多的血小板，導致在支架處形成急性血栓[31]。由于含銅不銹鋼支架自身能夠持續(xù)釋放微量銅離子，抑制支架表面血栓的形成，因而有利于抑制由血栓形成引發(fā)的支架內(nèi)再狹窄。

1.3 新型含銅金屬心血管支架材料的創(chuàng)新研究

鑒于上述Cu元素對人體冠脈系統(tǒng)的有益生物功能，包括促進血管內(nèi)皮化、抑制動脈平滑肌增生、降低血栓形成傾向等，以及Cu可作為合金化元素加入到結(jié)構(gòu)金屬中的材料特性，作者團隊通過在現(xiàn)有冠脈支架用金屬材料(316L不銹鋼、L605鈷基合金)中添加適量Cu元素，首次創(chuàng)新性開發(fā)出具有抑制支架內(nèi)再狹窄功能的新型含銅金屬心血管支架材料，并從多方面驗證了含銅金屬(316L-Cu不銹鋼、L605-Cu合金)對支架內(nèi)再狹窄的抑制作用。

2 316L-Cu不銹鋼對支架內(nèi)再狹窄的抑制作用研究

Cu離子具有促進血管生成的作用，因此可以嘗試在現(xiàn)有血管支架材料中適量添加Cu元素，使血管支架具有促進傷口愈合或加速血管新生的生物功能。在支架植入冠脈血管過程中，血管內(nèi)壁往往會受到損傷，這時平滑肌細胞向該部位遷移和增殖，導致新生內(nèi)膜的產(chǎn)生[32]。因此，增加內(nèi)皮細胞的活性，加速內(nèi)皮化過程，可以抑制平滑肌細胞的激活。此外，Cu離子對血栓形成及VSMC增殖的抑制作用亦會對抑制支架內(nèi)再狹窄起到關鍵作用。所以向支架材料中添加適量Cu元素，通過支架在冠脈中適量釋放Cu離子，有助于抑制支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生。

316L不銹鋼是第一款應用于臨床的金屬冠脈支架材料，由美國強生Cordis公司于1994年推向市場。但它是一種生物惰性材料，不會與機體組織主動發(fā)生有益的相互作用。近年來，作者團隊利用Cu離子對心血管系統(tǒng)的諸多有益作用，在316L不銹鋼中添加適量Cu，開發(fā)出具有抑制支架內(nèi)再狹窄功能的新型含銅316L不銹鋼(316L-Cu)[33,34]。這種新型支架材料在保持316L不銹鋼原有性能的基礎上，可以在心血管中持續(xù)和微量釋放Cu離子，從而實現(xiàn)促進內(nèi)皮化、抑制平滑肌增生、降低血栓形成傾向等多重生物功能，是一種有效降低支架內(nèi)再狹窄發(fā)生率的新一代心血管支架材料。

2.1 含銅不銹鋼對血管內(nèi)皮細胞的影響

2.1.1 內(nèi)皮細胞在材料表面上的粘附

在24 h和72 h共同培養(yǎng)后，316L-Cu不銹鋼表面上粘附的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)數(shù)量都明顯多于316L不銹鋼，且細胞之間連接緊密，生長狀態(tài)良好。從圖1所示的熒光染色照片可以看到，316L不銹鋼表面的HUVEC部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)，細胞核的染色質(zhì)高度凝聚和邊緣化，而且細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體，而316L-Cu不銹鋼表面上粘附的HUVEC沒有觀察到這種情況。以上實驗結(jié)果表明，316L-Cu不銹鋼具有促進HUVEC增殖的作用。

2.1.2 對細胞凋亡率的影響

采用Annexin V-FITC/PI流式細胞術(shù)檢測培養(yǎng)液以及316L和316L-Cu兩種不銹鋼浸提液分別對HUVEC凋亡情況的影響。在316L-Cu不銹鋼浸提液中培養(yǎng)的HUVEC凋亡細胞數(shù)量少于316L浸提液中培養(yǎng)的HUVEC凋亡數(shù)量，而培養(yǎng)液中的HUVEC凋亡細胞數(shù)量最少。表1給出了細胞凋亡率的具體計算結(jié)果，可見HUVEC的細胞凋亡變化趨勢與上文細胞粘附觀察結(jié)果是一致的。

圖1 HUVEC在316L不銹鋼(a)和316L-Cu不銹鋼(b)表面上培養(yǎng)24 h后的熒光染色照片F(xiàn)ig.1 Fluorescence staining images of HUVEC cultured on the surfaces of 316L stainless steel (a) and 316L-Cu stainless steel (b) for 24 h

表1 培養(yǎng)液、316L與316L-Cu不銹鋼浸提液對HUVEC的細胞凋亡率的影響[34]Table 1 The effect of culture solution,extracts from 316L and 316L-Cu stainless steel on the cell apoptosis rates of HUVEC[34]

2.1.3 細胞遷移

利用Transwell實驗考察材料對細胞遷移能力的影響。圖2為HUVEC的Transwell實驗結(jié)果。圖2b顯示，經(jīng)過24 h共培養(yǎng)后有大量經(jīng)過血清饑餓培養(yǎng)(已排除增殖對遷移能力影響)的HUVEC從Transwell insert 膜的上表面遷移至含有316L-Cu不銹鋼浸提液的Transwell下室，而圖2a中只有較少的HUVEC遷移至Transwell insert 膜的下表面，說明相比于316L不銹鋼，316L-Cu不銹鋼對HUVEC的遷移能力有明顯的提升作用。

圖2 Transwell實驗結(jié)果(HUVEC)：(a)316L不銹鋼浸提液，(b)316L-Cu不銹鋼浸提液Fig.2 The results of transwell essay of HUVEC with the extracts from 316L stainless steel (a),316L-Cu stainless steel (b)

2.1.4 定量PCR

進一步通過RT-qPCR實驗，考察316L和316L-Cu不銹鋼對促進血管生長的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和能夠合成NO促進血管舒張的eNOS酶的影響。從圖3可以看出，與316L-Cu不銹鋼共培養(yǎng)3 d后的血管內(nèi)皮細胞的VEGF和eNOS的mRNA表達均明顯高于316L不銹鋼，表明316L-Cu不銹鋼能顯著促進血管化過程。

圖3 內(nèi)皮細胞在不銹鋼表面培養(yǎng)3 d后VEGF(a)和eNOS(b)的mRNA相對表達量[35]Fig.3 Relative mRNA expressions of VEGF (a) and eNOS (b) in cells cultured on the surfaces of stainless steels for 3 d (*p<0.05 compared with 316L)[35]

2.1.5 小管生成實驗

小管生成實驗可以評定材料有無促進血管內(nèi)皮細胞形成管狀結(jié)構(gòu)的能力。由圖4小管生成實驗結(jié)果可以看出，316L不銹鋼組中的細胞還處于比較分散的狀態(tài)，而316L-Cu不銹鋼組中的細胞已經(jīng)連在了一起，形成了網(wǎng)絡狀結(jié)構(gòu)。這說明316L-Cu不銹鋼具有促進血管內(nèi)皮細胞形成小管結(jié)構(gòu)的能力。

圖4 小管生成實驗照片[35]Fig.4 Images of tube formation essay[35]

早在20年前就有研究表明[36]，銅離子能夠促進血管再生。目前已有許多研究結(jié)果證明銅離子能夠促進血管內(nèi)皮細胞的增殖，從而加快血管的再生進程。Hu等[9]研究表明，銅離子能強烈地誘導血管內(nèi)皮細胞增殖，其作用可以與bFGF(具有最佳刺激作用的血管內(nèi)皮細胞生長因子之一)相媲美，并且銅離子不會改變血管內(nèi)皮細胞的形態(tài)。McAuslan等[37]研究表明，銅離子是唯一能夠誘導血管內(nèi)皮細胞增殖并促進血管再生的金屬元素。然而，銅離子誘導血管內(nèi)皮細胞增殖的機理目前還不明確。支架內(nèi)再狹窄的過程是有限的，當支架植入處的血管表面內(nèi)皮化完成后，支架內(nèi)再狹窄現(xiàn)象即會停止。血管內(nèi)皮化的重建過程能夠抑制由VSMC增殖引發(fā)的內(nèi)膜增生，并且抑制炎癥的發(fā)生。由此可見，由于含銅不銹鋼能夠明顯促進血管內(nèi)皮細胞的增殖與遷移，加快血管的再生和重建，因此有利于抑制支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生。

2.2 含銅不銹鋼對動脈平滑肌細胞的影響

2.2.1 動脈平滑肌細胞在材料表面上的粘附

將動脈平滑肌細胞(VSMC)分別與316L和316L-Cu兩種不銹鋼共培養(yǎng)24 h、72 h，與316L-Cu不銹鋼相比，無論培養(yǎng)時間是24 h還是72 h，316L不銹鋼表面上粘附的VSMC數(shù)量都更多，且細胞密度大，細胞之間連接緊密，生長狀態(tài)良好；316L-Cu表面上粘附的VSMC細胞數(shù)量遠少于316L不銹鋼表面，且細胞密度小，更加稀疏。以上結(jié)果表明，在316L中加入適量銅元素后可明顯抑制VSMC在其表面上的增殖。

2.2.2 對細胞凋亡率的影響

在316L不銹鋼浸提液中培養(yǎng)的VSMC的凋亡細胞數(shù)量少于316L-Cu不銹鋼浸提液中培養(yǎng)的VSMC凋亡數(shù)量，而培養(yǎng)液中的VSMC凋亡細胞數(shù)量最少。表2給出了細胞凋亡率的具體計算結(jié)果，可見，研究培養(yǎng)液體對細胞凋亡的影響實驗結(jié)果與上文所述的細胞粘附觀察結(jié)果相一致，即316L-Cu不銹鋼對VSMC生存有明顯抑制作用。

表2 培養(yǎng)液、316L與316L-Cu不銹鋼浸提液中VSMC的細胞凋亡率[34]Table 2 The effect of culture solution,extracts from 316L and 316L-Cu stainless steel on the cell apoptosis rates of VSMC[34]

2.2.3 細胞遷移

針對VSMC的Transwell實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過24 h共培養(yǎng)后，有大量經(jīng)過血清饑餓培養(yǎng)(已排除增殖對遷移能力影響)的VSMC從Transwell insert膜的上表面遷移至含有316L不銹鋼浸提液的Transwell下室，而316L-Cu只有較少的VSMC遷移至Transwell insert 膜的下表面，說明相比于316L不銹鋼，316L-Cu不銹鋼對VSMC的遷移有明顯的抑制作用。

血管由內(nèi)膜、中膜和外膜構(gòu)成。VSMC存在于血管的中膜，是構(gòu)成血管并維持其正常生理功能的基礎，是決定血管活性、血管構(gòu)型及維持血管張力的重要因素。VSMC的代謝、功能的改變或表型轉(zhuǎn)化、異常增殖、遷移，與動脈粥樣硬化、高血壓、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)及冠狀動脈旁路移植術(shù)后血管再狹窄等的發(fā)生和發(fā)展密切相關。以上實驗均證明316L-Cu不銹鋼對VSMC遷移具有明顯的抑制作用，因而使用含銅不銹鋼制作冠脈支架，有望降低由VSMC遷移而引發(fā)的支架內(nèi)再狹窄的風險。

2.3 含銅不銹鋼對血栓形成的影響

2.3.1 動態(tài)凝血時間

動態(tài)凝血時間反映了材料與血液接觸后，內(nèi)源性凝血因子被激活的程度，可用以判斷材料對內(nèi)源性凝血過程的影響。圖5給出了利用光密度(O.D.)測定的316L和3176-Cu不銹鋼的動態(tài)凝血時間。O.D.值越高，表明材料表面的動態(tài)凝血時間越長?？梢钥闯?，316L-Cu不銹鋼在不同時間點的O.D.值均高于316L，說明與316L不銹鋼相比，316L-Cu不銹鋼表面上相對不易發(fā)生凝血。測定結(jié)果表明，316L不銹鋼與316L-Cu不銹鋼的全凝時間分別為77 min與120 min，后者大大長于前者。由此可見，316L-Cu不銹鋼抵御內(nèi)源性凝血的能力優(yōu)于316L不銹鋼。

圖5 316L不銹鋼和316-Cu不銹鋼的動態(tài)凝血時間比較[34]Fig.5 Comparison of effects of 316L and 316-Cu stainless steel on blood coagulation[34]

2.3.2 材料表面上的血小板粘附

血小板細胞質(zhì)膜上結(jié)合有多種凝血因子，在血液凝固過程中具有重要作用，而且血小板還具有黏附異物的功能。當植入材料與血液接觸后，血小板會在材料的表面黏附、聚集，達到一定程度后就會發(fā)生凝血，產(chǎn)生血栓。

圖6為316L和316L-Cu不銹鋼分別與血小板接觸180 min后，材料表面血小板黏附形貌的SEM照片。可以看出，與血小板接觸180 min后，316L不銹鋼表面黏附了較多血小板，而且血小板出現(xiàn)了明顯的聚集，有少部分已經(jīng)伸出了尾足。而316L-Cu不銹鋼表面僅黏附了極少量的血小板，血小板沒有發(fā)生聚集現(xiàn)象，保持了較好的形態(tài)。

動態(tài)凝血時間測定以及血小板粘附實驗結(jié)果均表明，與316L不銹鋼相比，316L-Cu不銹鋼能顯著抑制血小板在其表面上的粘附，且具有更長的全凝時間。

圖6 316L不銹鋼(a)和316L-Cu不銹鋼(b)與血小板接觸180 min后表面血小板黏附的SEM 照片F(xiàn)ig.6 Morphology of platelet adherent on different materials after 180 min: (a) 316L stainless steel,(b) 316-Cu stainless steel

2.4 生物安全性

采用ICP-MS技術(shù)檢測了316L-Cu不銹鋼在生理鹽水中浸泡至7 d內(nèi)的Cu離子釋放量，測得每日的Cu離子釋放量為5×10-9～10×10-9g/L。如果拿一枚316L-Cu不銹鋼冠脈支架進行測算，則其每日的Cu離子釋放量數(shù)量級為10-3μg，遠低于世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的成人每日的Cu攝入量(2～3 mg)。

委托國家藥監(jiān)局認可的四川醫(yī)療器械生物材料和制品檢驗中心按照國家相關試驗要求，對316L-Cu不銹鋼進行了部分生物安全性檢驗。結(jié)果表明，材料的細胞毒性為0～1級(細胞相對增值率為99.7%)，無遲發(fā)型超敏反應，無全身毒性，滿足國家標準要求。皮內(nèi)反應試驗結(jié)果也滿足國家標準要求。

2.5 動物植入研究

圖7是316L-Cu不銹鋼支架、316L不銹鋼支架、市售L605合金載藥支架分別植入豬冠脈后的血管內(nèi)皮細胞覆蓋情況照片?？梢钥吹街踩?4 d后，3種支架表面均發(fā)生了血管內(nèi)皮化。316L-Cu支架筋上幾乎完全被形貌規(guī)則的梭形內(nèi)皮細胞覆蓋，內(nèi)皮化完成良好。載藥支架筋也幾乎被內(nèi)皮所覆蓋，但仍然有少量裸露部分，且細胞形貌不規(guī)整。316L支架雖然被完整覆蓋，但可以觀察到很多白色點狀物，其是紅細胞、白細胞和血小板的復合物，意味著形成了較強的急性炎癥和血栓性反應。

采用HE染色進一步評價316L-Cu不銹鋼的促血管內(nèi)皮化效果。圖8所示是支架植入14 d后動物冠脈血管橫截面的HE染色照片。316L-Cu不銹鋼支架的血管內(nèi)皮化明顯優(yōu)于載藥支架，內(nèi)皮重建完整，覆蓋整個支架筋，且沒有發(fā)生血管內(nèi)膜增生。而載藥支架筋幾乎都裸露在外，內(nèi)皮化很差。316L不銹鋼支架的血管內(nèi)皮化成度介于316L-Cu不銹鋼支架和載藥支架之間，有部分支架筋裸露在外。從內(nèi)皮化程度的形態(tài)定量分析(圖8D)可以看到，316L-Cu不銹鋼支架明顯優(yōu)于另外兩種支架。

圖7 支架植入動物(豬)冠脈內(nèi)14 d后，血管內(nèi)皮細胞覆蓋和內(nèi)皮細胞形態(tài)學分析：(A)316L-Cu不銹鋼支架，(B)L605合金載藥支架，(C)316L不銹鋼支架[35]Fig.7 SEM images of surface characterization of explanted endovascular stent following 14 d in animal artery: (A) endothelial coverage above struts in 316L-Cu-BMS,(B) DES,and (C) 316L-BMS (fig.a1,b1,b2,c1 are the zoomed-in images indicated by the black squares in fig.A,B,C)[35]

圖8 支架植入14 d后的動物冠脈血管切片照片：(A)316L-Cu不銹鋼支架，(B)L605合金載藥支架，(C)316L不銹鋼支架；(D)內(nèi)皮化程度的形態(tài)定量分析[35]Fig.8 Photomicrographs of representative animal vessel sections afer 14 d intervention，representative Hematoxylin-eosin stain of explanted stents of 316L-Cu-BMS (A),DES (B),316L-BMS (C) (fig.a,b,c are the zoomed-in images indicated by the black squares in fig.A,B,C),and quantitative morphometric analysis of endothelialization scores (D)[35]

3 L605-Cu合金對支架內(nèi)再狹窄的抑制作用研究

L605鈷基合金是第二代冠脈支架材料，與第一代支架材料316L不銹鋼相比，它具有更加優(yōu)異的性能[38]。L605合金較高的密度提高了支架的射線可視性，使支架能更安全準確地輸送到病變處。此外，L605合金的抗拉強度更高，使支架在保持原有徑向力的同時，能加工得更細更薄，方便支架輸送到更細的血管中。同時，較薄的支架壁減少了與血管接觸的面積，金屬覆蓋率減小，有利于降低支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生率[39]。因此，L605鈷基冠脈支架開發(fā)成功后，很快便在臨床上得到了廣泛的應用。

鑒于316L-Cu不銹鋼在降低支架內(nèi)再狹窄作用方面取得的一系列研究結(jié)果，在相同的思想指導下，設計和開發(fā)出含銅L605(L605-Cu)合金，以期達到同樣的效果。為此主要對L605-Cu合金對血管內(nèi)皮化及凝血的作用開展了研究。

3.1 細胞增殖

利用CCK-8實驗可以研究內(nèi)皮細胞在材料表面的增殖情況。圖9為采用CCK-8實驗得到的內(nèi)皮細胞(HUVEC)在L605和L605-Cu合金表面上培養(yǎng)1 d和3 d后的增殖結(jié)果?？梢钥闯?，隨著共培養(yǎng)時間的增長，兩組材料表面的細胞數(shù)量均在增加。共培養(yǎng)1 d時，兩種材料表面上的細胞數(shù)量幾乎一致。共培養(yǎng)3 d時，L605-Cu合金表面上的細胞更多一些，但是與L605合金相比沒有統(tǒng)計學差異。

圖9 HUVEC在L605和L605-Cu合金表面上生長1 d和3 d后的增殖情況[40]Fig.9 Effect of experimental materials on the proliferation of HUVECs cultured for 1 d and 3 d,respectively[40]

3.2 細胞凋亡

表4給出了內(nèi)皮細胞在L605和L605-Cu合金表面上培養(yǎng)1 d和3 d后的凋亡率?？梢钥闯?，共培養(yǎng)1 d和3 d時，L605-Cu合金表面的內(nèi)皮細胞凋亡率均低于L605合金，表明其可以抑制內(nèi)皮細胞的早期凋亡。因此，其長期植入后能夠減緩內(nèi)皮細胞的死亡，有利于血管的內(nèi)皮化。

表4 內(nèi)皮細胞在L605和L605-Cu合金表面上培養(yǎng)后的凋亡率[40]Table 4 The cell apoptosis rates of HUVECs on the surfaces of L605 and L605-Cu alloys[40]

3.3 細胞形態(tài)

圖10為內(nèi)皮細胞分別在L605和L605-Cu合金表面上共培養(yǎng)1 d和3 d后的vWF蛋白及細胞骨架染色照片。可以看出，材料表面上的細胞均能正常表達vWF，共培養(yǎng)3 d后，L605-Cu合金表面上內(nèi)皮細胞的數(shù)量更多一些。圖10b顯示，共培養(yǎng)1 d時，兩種合金表面上的細胞鋪展情況均很好，L605-Cu表面上的細胞大多都伸出了絲狀偽足。共培養(yǎng)3 d時，相比于L605合金，L605-Cu合金表面上的細胞骨架微絲特異性染色更深，說明細胞中F-肌動蛋白的含量更高。由此可見，L605-Cu合金表面應更適合內(nèi)皮細胞的生長和遷移。

3.4 細胞遷移

劃痕實驗及Transwell實驗均能夠用于表征細胞的遷移能力。圖11a為劃痕實驗和Transwell實驗的照片。劃痕實驗結(jié)果顯示，24 h后兩種合金組中均有部分內(nèi)皮細胞遷移到了劃痕中間(圖中兩條直線代表劃痕剛形成時的位置)。分析初始和24 h拍攝的照片可知，L605和L605-Cu合金之間的細胞相對遷移面積沒有統(tǒng)計學差異(見圖11b)。然而在Transwell實驗中，有更多的內(nèi)皮細胞受到含Cu浸提液的作用而實現(xiàn)了遷移，并且分析結(jié)果顯示兩組之間存在統(tǒng)計學差異(圖11c)。

圖10 內(nèi)皮細胞在L605和L605-Cu合金表面生長1 d和3 d后的熒光染色照片：(a)vWF，(b)細胞骨架[40]Fig.10 Cell attachment on the surface of L605 and L605-Cu alloys: (a) vWF staining,(b) cytoskeleton staining[40]

圖11 L605及L605-Cu合金浸提液對內(nèi)皮細胞遷移的影響：(a)劃痕實驗及Transwell實驗的代表性照片，(b)劃痕實驗中的相對遷移面積，(c)Transwell實驗中的細胞遷移數(shù)[40]Fig.11 Effect of extracts from L605 and L605-Cu alloys on cell migration： (a) typical images of wound scratch assay and Transwell assay,(b) the quantitative analysis of scratch assay,(c) the amounts of cells migrated toward the extracts in Transwell assay[40]

3.5 小管生成

內(nèi)皮細胞的遷移能力得到增強后，可能會更快地形成血管。圖12a為內(nèi)皮細胞在L605和L605-Cu合金的浸提液作用下形成的毛細血管狀結(jié)構(gòu)的照片。L605-Cu合金的浸提液使內(nèi)皮細胞更快地形成了小管結(jié)構(gòu)；在同樣的時間內(nèi)，L605合金的浸提液中的內(nèi)皮細胞之間還沒有形成完整的網(wǎng)絡。通過對小管長度和節(jié)點數(shù)進行定量分析后發(fā)現(xiàn)，含Cu合金浸提液能明顯增加這兩個參數(shù)的值，證明L605-Cu合金能促進小管的生成(圖12b,12c)。所以，L605-Cu合金有望通過提升內(nèi)皮細胞的遷移能力和小管形成能力加速血管的內(nèi)皮化進程。

圖12 細胞在L605及L605-Cu合金浸提液的作用下形成的管腔結(jié)構(gòu)(a)以及小管長度(b)和節(jié)點數(shù)(c)定量的結(jié)果[40] Fig.12 Tube formation induced by extracts of L605 and L605-Cu,respectively (a),quantitation of the results by measuring tube length (b) and branching points (c)[40]

3.6 VEGF和NO的分泌及基因表達

VEGF和NO是在血管生成過程中很重要的兩種物質(zhì)。圖13a為內(nèi)皮細胞與樣品共培養(yǎng)1 d和3 d后，細胞培養(yǎng)上清液中的VEGF含量。由圖可知，雖然兩個合金組的數(shù)據(jù)之間沒有統(tǒng)計學差異，但是與L605相比，L605-Cu合金上清液中的VEGF含量平均值有輕微上升的趨勢。內(nèi)皮細胞與樣品共培養(yǎng)后，向培養(yǎng)液中釋放的NO量隨著培養(yǎng)時間的增長而增加，但L605和L605-Cu兩個合金組之間的數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計學差異(見圖13b)。RT-qPCR實驗結(jié)果說明，L605-Cu合金使VEGF的mRNA表達增加了1.8倍(見圖13c)，但并不能增加eNOS的mRNA表達(見圖13d)。

已有研究證實，Cu離子能夠增加內(nèi)皮細胞中VEGF的合成和分泌[38,39,41]。盡管L605-Cu合金能夠明顯增加內(nèi)皮細胞中VEGF的mRNA相對表達量，但是卻沒有增加VEGF的分泌量。這可能是由于共培養(yǎng)的時間不夠充分，不足以使兩個合金組之間表現(xiàn)出差異性。盡管很多含Cu材料也能夠增加內(nèi)皮細胞中NO的合成與分泌，但是L605-Cu合金并沒有展現(xiàn)出同樣的性能，這可能是因為L605-Cu合金在檢測時間內(nèi)溶出的Cu離子量不足以起到該作用。

3.7 動態(tài)凝血

在動態(tài)凝血實驗中，血液的凝固程度同游離的血紅蛋白數(shù)量成反比，所以凝固的越快，吸光度的值越低。如圖14所示，在90 min的測定時間內(nèi)，L605-Cu合金表面上的血液凝固時間始終大于L605合金的血液凝固時間。因此，L605-Cu合金的血栓發(fā)生率更低。支架的植入易導致血管內(nèi)壁受損，引發(fā)凝血級聯(lián)反應。因而支架表面對凝血的影響十分重要，L605-Cu合金更加優(yōu)異的血液相容性有助于減少血栓的發(fā)生。

圖13 共培養(yǎng)上清液中VEGF(a)及NO(b)的含量，共培養(yǎng)3 d后細胞中VEGF(c)及eNOS(d)的mRNA相對表達量[40] Fig.13 Concentrations of VEGF (a) and NO (b) in supernatant,gene expressions of VEGF (c) and eNOS (d) in cells cultured for 3 days[40]

圖14 L605和L605-Cu合金的動態(tài)凝血趨勢Fig.14 Effects of L605 and L605-Cu on blood coagulation

4 結(jié) 語

從以上研究結(jié)果可以看出，通過在含銅金屬表面持續(xù)和微量釋放Cu離子，使醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)的Cu離子在維持和修復心血管方面的有益作用得到驗證。無論是體外實驗還是體內(nèi)實驗，都證明含銅金屬表面釋放的微量Cu離子能夠促進血管生成，并具有抑制動脈平滑肌細胞增殖和降低血栓形成幾率的作用，這些有益作用均有助于降低支架內(nèi)再狹窄發(fā)生率。由此可見，Cu離子通過對一系列生長因子的調(diào)控作用來影響血管的功能，進而對心血管系統(tǒng)的健康產(chǎn)生重大影響。因此，在現(xiàn)有心血管支架用金屬材料中適量添加Cu是一種有效減小支架內(nèi)再狹窄發(fā)生風險的新途徑，新型含銅金屬材料有望成為新一代心血管支架材料而得到臨床應用。