黃寧 劉艷秋 丁書(shū)軍

江西省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心（南昌330006）

我國(guó)是出生缺陷高發(fā)國(guó)家之一，出生缺陷給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)，如何進(jìn)行高效的產(chǎn)前診斷，減少出生缺陷的發(fā)生仍是很多產(chǎn)前診斷專家的重點(diǎn)關(guān)注領(lǐng)域。近年來(lái)隨著測(cè)序成本的不斷降低，數(shù)據(jù)分析水平的不斷提高，全基因組測(cè)序（whole-genome sequencing，WGS）已在腫瘤的診斷、治療及預(yù)后，復(fù)雜性疾病特別是兒童罕見(jiàn)遺傳病的診斷上得到運(yùn)用，并逐步走向臨床，但在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的應(yīng)用報(bào)道較少。本文將研究WGS技術(shù)在產(chǎn)前診斷染色體病方面的診斷價(jià)值。WGS無(wú)需細(xì)胞培養(yǎng)，能夠在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)全基因組水平進(jìn)行掃描，可檢測(cè)染色體拷貝數(shù)變異，尤其在微小結(jié)構(gòu)異常檢出方面具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取自2017年3月至2017年12月期間在江西省婦幼保健院就診并接受產(chǎn)前診斷孕婦500例，其中羊水產(chǎn)前診斷370例，臍血產(chǎn)前診斷130例。產(chǎn)前診斷指征包括高齡、唐篩高危、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)陽(yáng)性、B超檢查胎兒發(fā)育異常、夫婦一方染色體異常及異常產(chǎn)史，這些孕婦均經(jīng)知情選擇，同意進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

1.2 研究方法所有孕婦均進(jìn)行遺傳咨詢，簽署了產(chǎn)前診斷知情同意書(shū)，明確了產(chǎn)前診斷流程、羊水或臍血全基因組測(cè)序分析和染色體核型分析的目的意義、局限性及出現(xiàn)不明意義結(jié)果的可能性，詳細(xì)記錄孕產(chǎn)史、家族史、末次月經(jīng)及個(gè)人基本信息等資料，依據(jù)孕周不同，分別進(jìn)行羊膜腔穿刺術(shù)和臍帶血穿刺術(shù)，所有羊水和臍血標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行全基因組測(cè)序拷貝數(shù)變異分析和細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析。此項(xiàng)研究獲得江西省婦幼保健院倫理委員會(huì)同意。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)前診斷適應(yīng)癥及結(jié)果分布共計(jì)500例孕婦接受產(chǎn)前診斷，其中75%為B超檢測(cè)胎兒發(fā)育異常和胎兒無(wú)創(chuàng)DNA陽(yáng)性，檢出異常病例71例，429例未見(jiàn)異常。71例異常病例中，B超胎兒發(fā)育異常者檢出29例，其中21三體8例，18三體3例，13三體2例，45，X檢出1例，臂間倒位4例，非平衡性染色體結(jié)構(gòu)異常4例，染色體微缺失微重復(fù)5例，嵌合體2例；無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)異常者檢出27例，其中21三體2例，18三體1例，性染色體數(shù)目異常14例，臂間倒位2例，非平衡性染色體結(jié)構(gòu)異常3例，染色體微缺失微重復(fù)3例，嵌合體2例；異常孕產(chǎn)史者檢出2例，1例為非平衡性染色體結(jié)構(gòu)異常，1例為染色體微重復(fù)；唐篩高危者檢出3例，2例為臂間倒位，1例為染色體微重復(fù)，提示疑似致病變異；夫婦一方染色體異常者檢出異常10例，均為親代來(lái)源的臂間倒位和染色體平衡易位。見(jiàn)表1。

表1 不同適應(yīng)癥產(chǎn)前診斷結(jié)果分布Tab.1 Pregnant diagnosis of different indications 例（%）

2.2 異常檢出結(jié)果500例WGS和胎兒細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析成功率100%，檢出異常染色體71例，異常率14.2%。其中胎兒細(xì)胞染色體核型分析檢出61例異常核型，異常率12.2%（61/500），包括21三體10例，18三體4例，13三體2例，性染色體數(shù)目異常15例，平衡易位8例，染色體倒位10例，嵌合體4例，非平衡性染色體結(jié)構(gòu)異常8例；另WGS檢出10例微缺失微重復(fù)病例。

3 討論

新一代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）的飛速發(fā)展不僅大幅減少了基因組檢測(cè)費(fèi)用，還縮短了檢驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)，能有效為檢測(cè)對(duì)象提供快速、全面的報(bào)告。全基因組測(cè)序作為一項(xiàng)準(zhǔn)確性高、全面覆蓋性好、經(jīng)濟(jì)有效的檢測(cè)手段，勢(shì)必會(huì)改變當(dāng)前人類健康檢驗(yàn)?zāi)Ｊ剑?］。當(dāng)前NGS已在腫瘤診斷、治療和預(yù)后等領(lǐng)域發(fā)生了深刻的變化，很多腫瘤中心正在考慮將全基因組測(cè)序或全外顯子測(cè)序技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床［2-3］。在產(chǎn)前檢測(cè)領(lǐng)域，應(yīng)用NGS技術(shù)進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前非整倍體檢測(cè)（noninvasive prenatal testing for aneuploidy，NIPT）已在國(guó)內(nèi)推廣使用［4］。臨床上已將WGS和全外顯子測(cè)序（WES）用于罕見(jiàn)遺傳性疾病診斷，尤其是一些兒童疑難復(fù)雜疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷［5-7］。已有研究表明，基于多種分析策略及多種測(cè)序平臺(tái)的應(yīng)用，均證實(shí)WGS技術(shù)的高效性和實(shí)用性［8-9］。

本文中500例產(chǎn)前診斷孕婦，染色體病異常檢出率為14.2%（71/500），其中WGS在染色體非整倍體檢出的基礎(chǔ)上，又檢出10例染色體微缺失微重復(fù)病例，相對(duì)于傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)，提高了2%（10/500）檢出率。如果沒(méi)有運(yùn)用WGS這一技術(shù)，那么將會(huì)大大限制產(chǎn)前診斷的檢測(cè)潛能，一部分拷貝數(shù)變異（copy number variants，CNVs）將無(wú)法檢出，這些胎兒將會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重殘疾。這一結(jié)果表明WGS技術(shù)相較于染色體核型分析，具有進(jìn)一步提高產(chǎn)前診斷中致死致殘嚴(yán)重染色體病的檢出潛能。

傳統(tǒng)400條帶G顯帶染色體核型分析分辨水平在10 M左右，而WGS的檢測(cè)能力可達(dá)到100 Kb水平，這一技術(shù)優(yōu)勢(shì)是細(xì)胞學(xué)技術(shù)無(wú)法比擬的。WGS不僅可以檢測(cè)微小CNVs，還可以判斷不明來(lái)源染色體片段或結(jié)構(gòu)。一例臍血病例中，B超提示胎兒頸部囊腫，染色體核型分析46，XN，add（6）（q27），即6號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端附著一未知來(lái)源染色體片段。該例孕婦同時(shí)進(jìn)行了WGS檢測(cè)，提示有一個(gè)大小為2.99 Mb的缺失存在于6q27和一個(gè)39.06 Mb大小的重復(fù)存在于10p11.1p15.3，均為已知致病變異［10-11］?？紤]到該例孕婦孕周已達(dá)25周，臍血穿刺后兩周即出具了診斷報(bào)告，沒(méi)有等待夫婦外周血染色體比對(duì)分析，有助于孕婦及其家屬盡早抉擇。

眾所周知，染色體核型分析受人員、技術(shù)、細(xì)胞質(zhì)量等多因素影響，分辨水平受制片質(zhì)量影響較大，即使一些400條帶水平小的結(jié)構(gòu)異常也容易被忽略，而WGS正好可以彌補(bǔ)這一缺陷。一例羊水病例中，該名孕婦既往生育一胎，多發(fā)畸形而夭折，染色體核型分析46，XN，9p 22，即9號(hào)染色體短臂末端缺少一條深帶，其他染色體無(wú)異常，考慮為9號(hào)染色體部分單體；WGS提示有一個(gè)19.05 Mb大小的缺失位于9p22.1p24.3，一個(gè)8.85 Mb大小的重復(fù)位于20p12.3p13，結(jié)合兩者分析結(jié)果判斷該孕婦核型為 46，XN，der（9）t（9；20）（p22；p13），及時(shí)對(duì)孕婦進(jìn)行知情告知，并進(jìn)行了夫婦外周血染色體比對(duì)，證實(shí)為父系遺傳。

在10例微缺失微重復(fù)病例中檢出2例為疑似致病變異，1例孕婦24歲，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)10號(hào)染色體微重復(fù)，羊水WGS提示46，XN，dup（10q22.3q23.2），重復(fù)片段大小為7.43 Mb，1例孕婦36歲，唐篩18三體高風(fēng)險(xiǎn)，羊水WGS提示46，XN，dup（2q13），重復(fù)片段大小為1.77 Mb。此兩例均為新發(fā)突變，有研究［12-13］表明10q22.3q23.2區(qū)域的重復(fù)變異可能導(dǎo)致表型變異，有研究［14-15］表明2q13區(qū)域的重復(fù)變異為致病變異，但個(gè)體間臨床表現(xiàn)具有差異性，還需結(jié)合臨床做進(jìn)一步分析。目前這兩例病例仍在繼續(xù)妊娠，B超檢測(cè)無(wú)異常，我們將會(huì)密切隨訪關(guān)注。另8例CNV病例中5例為B超檢測(cè)胎兒發(fā)育異常，2例無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)陽(yáng)性，1例孕婦為異常孕產(chǎn)史，均提示為明確致病，檢出異常變異最小僅為640.49 kb。此8例孕婦在充分知情告知后均選擇終止妊娠。

當(dāng)前WGS沒(méi)有作為一項(xiàng)常規(guī)檢測(cè)運(yùn)用于臨床，受技術(shù)水平和遺傳咨詢能力所限，特別是在一些基層醫(yī)療單位難以開(kāi)展。相對(duì)于傳統(tǒng)染色體核型分析，WGS對(duì)產(chǎn)前診斷檢測(cè)潛能有較大的提升，尤其在一些微缺失微重復(fù)綜合征的檢測(cè)方面。但同時(shí)也會(huì)有部分病例增加遺傳咨詢難度。