李俊芬， 張 琳， 樊 鴿， 李鵬霞， 董 川

(1.山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西太原 030006；2.山西大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程研究中心，山西太原 030006)

1962年，Gellert[1]課題組證實(shí)富G核酸單鏈中的四個(gè)鳥嘌呤殘基通過Hoogsteen氫鍵形成四分體結(jié)構(gòu)，四分體與四分體間利用π-π作用連接便形成G -四鏈體[2]。根據(jù)DNA單鏈的來源和數(shù)目不同，G -四鏈體可分為分子內(nèi)G -四鏈體和分子間G -四鏈體兩種；根據(jù)DNA單鏈的走向和loop連接方式的不同，G -四鏈體可分為平行G -四鏈體結(jié)構(gòu)、反平行G -四鏈體結(jié)構(gòu)和混合G -四鏈體結(jié)構(gòu)[3]。G -四鏈體在調(diào)控基因的復(fù)制與表達(dá)、延長端粒序列等方面起著至關(guān)重要的作用[4]。研究表明，人類染色體末端富G序列形成的G -四鏈體可以阻斷在腫瘤細(xì)胞中高活性表達(dá)的端粒酶對端粒DNA引物的識別，從而達(dá)到抗腫瘤的目的[5]；c -myc啟動(dòng)子序列中的Pu27形成的G -四鏈體DNA可以顯著抑制腫瘤的生長，原癌基因c -kit、bcl-2、RET等序列也可形成G -四鏈體結(jié)構(gòu)，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[5]。能夠穩(wěn)定G -四鏈體結(jié)構(gòu)或者誘導(dǎo)富G序列形成G -四鏈體結(jié)構(gòu)的配體分子已成為近年來開發(fā)抗癌藥物的熱點(diǎn)。

圖1 巴馬汀的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of palmatine

鹽酸巴馬汀是存在于黃連中的一類生物堿成分，具有高效的生物活性和較好的水溶性，且能夠增強(qiáng)白細(xì)胞的吞噬能力，具有抗菌殺毒作用[6]，巴馬汀的結(jié)構(gòu)式見圖1。郝潤等[7]發(fā)現(xiàn)小檗堿和巴馬汀對端粒G -四鏈體和原癌基因啟動(dòng)子區(qū)域G -四鏈體都有著較好的相對親和性和選擇性，有望成為靶向G -四鏈體的高效抗癌藥物。目前有關(guān)鹽酸巴馬汀與G -四鏈體相互作用的光譜研究還沒有系統(tǒng)報(bào)道。

本文通過熒光滴定光譜、紫外滴定光譜、圓二色譜(CD)以及1H NMR譜探究了鹽酸巴馬汀與G -四鏈體之間的相互作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鹽酸巴馬汀和DNA有很強(qiáng)的結(jié)合作用，結(jié)合作用模式為末端堆積。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4500型熒光分光光度計(jì)(日本，日立公司)；U-2910型紫外-可見分光光度計(jì)(日本，日立公司)；MOS 450型多功能圓二色譜儀(法國，Bio-Logic公司)；LX-200型迷你型離心機(jī)(7 000 r/min)，AVANCE ⅢHD核磁共振儀(德國，布魯克公司)；Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀(美國，賽墨飛世爾科技)。

Tris(Biosharp生物科技)；鹽酸巴馬汀(中國藥品生物制品檢定所)；ABTS(Sigma)；核酸適配體PS2.M(5′-GTGGGTAGGGCGGGTTGG -3′，上海強(qiáng)耀生物科技有限公司)。實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為分析純，用水為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1溶液的配制鹽酸巴馬汀用Tris-HCl緩沖液配制成2.5×10-3mol/L儲備液。DNA用Tris-HCl緩沖溶液溶解，在90 ℃水浴鍋中恒溫加熱10 min，自然冷卻至室溫后，放置于冰箱(4 ℃)中，其準(zhǔn)確濃度由260 nm處吸光度值計(jì)算。以上溶液使用時(shí)適當(dāng)稀釋。pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液參照文獻(xiàn)方法配制。核磁實(shí)驗(yàn)所用的Tris-HCl由90%去離子水和10%氘代水配制而成。H2O2(20 mmol/L)、Hemin(20 mmol/L)及ABTS(20 mmol/L)均用Tris-HCl緩沖液配制。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法(1)紫外可見光譜滴定：向1 cm比色皿中加入2.5 mL Tris-HCl緩沖溶液和8 μL鹽酸巴馬汀儲備溶液，Tris-HCl溶液做參比，以微量進(jìn)樣器每次分別向樣品和參比液中滴加0.5 μL DNA，攪拌靜置30 s后掃描吸收光譜。(2)熒光滴定光譜：固定鹽酸巴馬汀的濃度為1.25×10-5mol/L，每次滴加0.5 μL DNA，攪拌靜置30 s后掃描熒光光譜，直至熒光強(qiáng)度幾乎不變(激發(fā)和發(fā)射狹縫分別為5.0 nm和10.0 nm，激發(fā)波長為320 nm)。(3)圓二色譜：移取350 μL Tris-HCl緩沖溶液和2.5 μL G -四鏈體DNA于1 cm石英比色皿中，每次滴加10 μL鹽酸巴馬汀進(jìn)行掃描，直到譜圖強(qiáng)度無明顯變化。(4)核磁共振譜：將500 μL 1.1×10-3mol/L DNA、150 μL 3.71×10-3mol/L DNA和350 μL 1.73×10-3mol/L鹽酸巴馬汀的混合液分別加入核磁管中，掃描1H NMR。(5)鹽酸巴馬汀/G -四鏈體/Hemin配合物的過氧化酶抑制實(shí)驗(yàn)[8]：向96孔板中加入10 μL 20 mmol/L G -四鏈體DNA，100 μL 20 mmol/L鹽酸巴馬汀，用緩沖溶液定容至190 μL，室溫放置2 h。加入10 μL 20 mmol/L Hemin，攪拌靜置1 h，最后加入4 μL 20 mmol/L的2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)溶液，當(dāng)加入6 μL 20 mmol/L H2O2時(shí)，反應(yīng)開始，用酶標(biāo)儀檢測其在415 nm波長處的吸光度，連續(xù)測試35 min并繪制曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹽酸巴馬汀與G -四鏈體DNA的紫外滴定光譜

配體與G -四鏈體作用后，其發(fā)色團(tuán)會因與G -四鏈體DNA的相互作用而產(chǎn)生不同程度的減色(紅移)/增色(藍(lán)移)現(xiàn)象。從圖2可以看出鹽酸巴馬汀在波長340 nm和418 nm附近的最大吸收峰的吸光度隨著G -四鏈體DNA的加入不斷減弱，減色率分別為39.5%和41.2%，最大吸收波長分別紅移了14 nm和18 nm，并且在356、366、450 nm附近出現(xiàn)等吸收點(diǎn)，說明鹽酸巴馬汀通過π-π堆積作用與G -四鏈體發(fā)生了較強(qiáng)的結(jié)合，插入到兩個(gè)G -四分體平面之間，形成夾心結(jié)構(gòu)或者堆積到了G -四鏈體末端的G -四分體平面上[9]。

2.2 鹽酸巴馬汀與G -四鏈體DNA的熒光滴定光譜

鹽酸巴馬汀的水溶液熒光較弱，但隨著G -四鏈體DNA的逐漸加入，鹽酸巴馬汀在波長534 nm附近的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，如圖3所示，再次表明鹽酸巴馬汀的剛性平面結(jié)構(gòu)與G -四鏈體發(fā)生了π-π堆積作用，其周圍環(huán)境極性降低，減弱了溶劑對鹽酸巴馬汀熒光的猝滅作用，從而熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。另外，鹽酸巴馬汀的最大發(fā)射峰從530 nm藍(lán)移至522 nm，這可能是由于鹽酸巴馬汀與G -四鏈體形成了締合體，減少了分子碰撞從而減少能量損失[10]。

采用連續(xù)等摩爾變化曲線法考察鹽酸巴馬汀與G -四鏈體DNA作用的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)[11]，由熒光強(qiáng)度對兩者摩爾比作圖，如圖4所示。由圖可見鹽酸巴馬汀與G -四鏈體DNA之間是單一的鍵合模式,結(jié)合比為1∶1。此時(shí)可遵循Scatchard方程計(jì)算結(jié)合常數(shù)[11 - 12]，曲線見圖5。由直線的斜率和截距得到結(jié)合常數(shù)K=4.83×106L/mol，結(jié)合位點(diǎn)n=0.75。說明鹽酸巴馬汀與G -四鏈體產(chǎn)生了較強(qiáng)的結(jié)合。

圖2 G -四鏈體DNA與鹽酸巴馬汀的紫外滴定光譜Fig.2 Ultraviolet titration spectra of palmatine chloride with G -quadruplex DNAcpalmatine=1.6×10-5 mol/L，curves from up to down:cDNA=0 - 1.3×10-5 mol/L.

圖3 G -四鏈體DNA與鹽酸巴馬汀的熒光滴定光譜Fig.3 Fluorescence titration spectra of palmatine chloride with G -quadruplex DNAcpalmatine=1.25×10-5 mol/L，curves from down to up:cDNA=0 - 3.2×10-5 mol/L.

圖4 G -四鏈體DNA與鹽酸巴馬汀的等摩爾變化曲線Fig.4 Job’s plot of the interaction between G -quadruplex DNA and palmatine chloride obtained by different concentration ratios

圖5 G -四鏈體與鹽酸巴馬汀作用的Scatchard圖Fig.5 Scatchard plot showing the interaction between G -quadruplex DNA and palmatine chloride

2.3 鹽酸巴馬汀與G -四鏈體相互作用的圓二色譜研究

圓二色譜(CD)常被用于研究小分子配體與DNA的相互作用或化合物構(gòu)象的變化規(guī)律[13]。圖6為鹽酸巴馬汀與G -四鏈體相互作用的圓二色滴定曲線。由圖可看出，CD譜圖在263 nm附近出現(xiàn)正的最大峰值，在242 nm附近出現(xiàn)負(fù)的最大峰值，這說明PS2.M在K+的存在下形成了平行的分子內(nèi)G -四鏈體結(jié)構(gòu)[14]。加入鹽酸巴馬汀后，G -四鏈體位于240 nm處的負(fù)吸收峰和263 nm附近正吸收峰強(qiáng)度改變，但峰位置沒有顯著變化。以上結(jié)果表明，鹽酸巴馬汀與G -四鏈體DNA形成了復(fù)合物，穩(wěn)定了G -四鏈體結(jié)構(gòu)，同時(shí)G -四鏈體構(gòu)象未發(fā)生變化。

2.4 鹽酸巴馬汀與G -四鏈體DNA相互作用的 1H NMR研究

Watson-Crick堿基對(NH…N)氫鍵存在時(shí)，亞胺質(zhì)子化學(xué)位移在13～14 ppm；而形成G -四鏈體結(jié)構(gòu)時(shí)，鳥嘌呤氫鍵(NH…O)的化學(xué)位移在 10.5～12 ppm范圍內(nèi)[15]。本文利用二維NOE 增強(qiáng)譜(NOESY)，在300 ms,25 ℃條件下研究了G -四鏈體結(jié)構(gòu)及其與巴馬汀的相互作用。亞氨基質(zhì)子交換緩慢，一般可研究50～300 ms范圍的1H NMR圖，從而得到更詳細(xì)的G -四鏈體結(jié)構(gòu)信息[16]。圖7中，G -四鏈體本身譜圖的低場區(qū)出現(xiàn)了四個(gè)峰，表明四分體的形成；加入鹽酸巴馬汀后，其中兩個(gè)峰消失，另外兩個(gè)峰位置移動(dòng)，且峰強(qiáng)度減弱，表明巴馬汀與G -四鏈體產(chǎn)生了作用。

圖6 鹽酸巴馬汀與G -四鏈體DNA的圓二色滴定曲線Fig.6 CD titration curves of palmatine chloride with G -quadruplex DNAcDNA=3.5×10-5 mol/L,a-g:c palmatine =0 - 7.1×10-5 mol/L.

圖7 鹽酸巴馬汀與G -四鏈體的 1H NMR譜Fig.7 1H NMR spectra of the mixture of palmatine chloride with G -quadruplex DNA"a" is the 1H NMR curve of the interaction between palmatine chloride and G -quadruplex DNA；"b" is the 1H NMR curve of G -quadruplex DNA.

這可能是由于鹽酸巴馬汀與G -四鏈體作用后加大了G -四鏈體亞氨基質(zhì)子周圍的電子云密度，屏蔽效應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致G -四鏈體峰位向高場移動(dòng)[17]。由于G -四鏈體的質(zhì)子交換一直處于動(dòng)態(tài)變化中，且實(shí)驗(yàn)所需的DNA濃度較大，具體結(jié)合位點(diǎn)還有待進(jìn)一步研究。

2.5 過氧化酶抑制實(shí)驗(yàn)

利用競爭實(shí)驗(yàn)可以探究鹽酸巴馬汀與G -四鏈體的結(jié)合方式是否為末端堆積。Yang等[18]報(bào)道Hemin堆積到G -四鏈體上后會釋放過氧化酶，在H2O2存在時(shí)，會對ABTS2-產(chǎn)生氧化作用，其催化氧化產(chǎn)物在415 nm附近有紫外吸收。當(dāng)G -四鏈體的其他配體與Hemin具有相同的結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，它將與Hemin競爭結(jié)合G -四鏈體，并減緩G -四鏈體/Hemin復(fù)合物產(chǎn)生過氧化酶的速率，從而降低相應(yīng)催化氧化產(chǎn)物的吸光度。圖8為鹽酸巴馬汀G -四鏈體/Hemin配合物的過氧化酶抑制活性曲線，由圖可知，在不含鹽酸巴馬汀的對照組中，G -四鏈體/Hemin的催化氧化產(chǎn)物在415 nm處的吸光度隨時(shí)間變化先迅速增強(qiáng)后緩慢下降，加入鹽酸巴馬汀后，其催化氧化產(chǎn)物吸光度的增加明顯受到抑制，說明鹽酸巴馬汀與Hemin具有相同的結(jié)合位點(diǎn)，據(jù)此，我們推測鹽酸巴馬汀與G -四鏈體的作用模式為末端堆積。鹽酸巴馬汀與G -四鏈體的作用及其與Hemin的競爭模擬見圖9。

圖8 鹽酸巴馬汀與G -四鏈體/Hemin配合物的過氧化酶抑制活性Fig.8 Inhibition effect of palmatine chloride on the peroxidase activity of G4 DNA/Hemin complex"a" is the curve of the peroxidase activity of G4 DNA/Hemin complex;"b" is the curve of inhiblition effect of polmatine on the peroriolase activity of G4 DNA/hemin complex.

圖9 鹽酸巴馬汀與G -四鏈體的作用及其與Hemin的競爭實(shí)驗(yàn)?zāi)M圖Fig.9 The simulation of the interaction between G -quadruplex and palmatine chloride and competition of palmatine with hemin

3 結(jié)論

采用多種光譜手段探究了鹽酸巴馬汀與G -四鏈體之間的相互作用。紫外滴定光譜及熒光現(xiàn)象表明鹽酸巴馬汀通過π-π堆積作用使G -四鏈體結(jié)構(gòu)達(dá)到穩(wěn)定；根據(jù)Scatchard方程計(jì)算結(jié)合常數(shù)K為4.83×106L/mol，結(jié)合比n為1∶1；圓二色譜證實(shí)在K+存在下，核酸適配體PS2.M形成了平行的G -四鏈體結(jié)構(gòu)，鹽酸巴馬汀沒有改變G -四鏈體的構(gòu)象；1H NMR也表明鹽酸巴馬汀能夠與G -四鏈體發(fā)生相互作用并穩(wěn)定G -四鏈體結(jié)構(gòu)。鹽酸巴馬汀/G -四鏈體/Hemin配合物的過氧化酶抑制實(shí)驗(yàn)表明：兩者作用模式為末端堆積。