試論細菌內(nèi)毒素檢查法在藥品檢驗中的應(yīng)用價值

王閆

摘 要：在藥品檢測中我們常用到的細菌內(nèi)毒素檢查法是一種非常方便、快速、靈敏度高、操作簡單的檢驗方式，并且這種方式能夠帶來很好的社會和經(jīng)濟效益，在中、美、日、英等國家的藥典中均有相關(guān)的記載，也是現(xiàn)代社會中最常用的細菌內(nèi)毒素檢查法之一。細菌內(nèi)毒素檢查的方法有兩種：凝膠限量法和光度定量測定法。通過這兩種方式我們可以在藥品檢驗、制藥工藝、臨床醫(yī)學等方面進行相關(guān)的探究。本文重點講述的則是在藥品檢驗方面進行的相關(guān)探究與研討并對此作出相關(guān)的分析和解釋。

關(guān)鍵詞：細菌內(nèi)毒素；藥品檢驗；鱟試驗法

1 鱟試驗法的原理

細菌內(nèi)毒素（英文是Endotoxin）是革蘭陰性菌細胞壁個層上的特有的一種結(jié)構(gòu)。而內(nèi)毒素可以作為外源性致熱源，激活中性粒細胞，并使中性粒細胞釋放出一種為內(nèi)源性熱原質(zhì)的物質(zhì)，可以作用于人體的體溫調(diào)節(jié)中樞進而引起人體發(fā)熱。在靜脈注射時所使用的藥品中，所含有的細菌內(nèi)毒素如果超過一定的濃度，就會使人體的體溫升高發(fā)生熱原反應(yīng)，這就會對藥品的安全性產(chǎn)生一定的質(zhì)疑。1968年美國的兩位科學家Levin和Bang研究出來的用鱟試驗法來檢查細菌內(nèi)毒素的方法中可以看出鱟試劑中的鱟血細胞受到細菌內(nèi)毒素的作用會發(fā)生一系列的凝集霉的反應(yīng)，形成一些用肉眼就可以觀察到的凝固蛋白凝膠。所以我們將通過這個原理用鱟試劑來進行檢測，進而判斷出供試品中的細菌內(nèi)毒素的限量是否符合相關(guān)規(guī)定。

2 細菌內(nèi)毒素檢查法的具體試驗過程

2.1 內(nèi)毒素標準品的簡單介紹

國家標準中的細菌內(nèi)毒素是從大腸埃希菌中提出并進行精煉而得到的。一般會在標定、復核、仲裁鱟試劑靈敏度和標定細菌內(nèi)毒素工作標準品效價的時候使用。細菌內(nèi)毒素的用量我們用內(nèi)毒素的單位EU來表示，1EU和1個內(nèi)毒素國際單位（IU）相當。每1ng的工作標準品效價不能夠小于2EU，也不能大于50EU，并且我們的數(shù)據(jù)要具有一定的穩(wěn)定性和均一性，不能任意波動。

2.2 實驗的注意事項

實驗前要先將手用肥皂清洗干凈，然后再用純度為75%的酒精消毒；在移液管取樣的時候要做好防止氣體混入到移液管當中的準備；反應(yīng)的過程中為了防止凝膠破碎進而導致假陰性的結(jié)果所以我們要保持試管比較平穩(wěn)的移動避免大幅度的震動；在靈敏度的重新檢驗和干擾試驗的時候兩組實驗應(yīng)該同時進行；整個試驗應(yīng)該在干凈的環(huán)境當中進行，防止有其他的微生物對試驗造成不必要的干擾。

2.3 進行實驗之前的準備工作

先把實驗玻璃器皿放在酪酸洗液或者其他的熱原滅活劑或清洗劑中充分的浸泡，然后將洗液處理干凈并用蒸餾水將玻璃皿沖洗三遍以上；再將玻璃皿放在250℃的干燥箱中干烤30分鐘以上，以除去可能存在的其他外源性內(nèi)毒素對試驗產(chǎn)生的干擾。

2.4 對鱟試劑的靈敏度進行再次檢驗

根據(jù)鱟試劑靈敏度的標示值（A），將細菌內(nèi)毒素的標準品和專門的專門的檢查水利用旋渦混合器混合溶解15分鐘，完成之后再逐級兩倍稀釋，并計算出鱟試劑靈敏度的測定值（AC）。對鱟試劑的靈敏度進行再次檢驗時要嚴格執(zhí)行每批選擇新的鱟試劑。除此之外我們還要將稀釋倍數(shù)加大的試劑進行不干擾試驗，排除其他干擾因素的影響。

2.5 實驗的具體操作過程

取四個相同的試管，在每個試管中都加入0.1ml的鱟試劑和細菌內(nèi)毒素檢查用水0.1ml，是兩種溶液相溶解。取其中的任意兩只試管，并在試管中加入最大稀釋倍數(shù)的供試品溶液0.1ml，并將這兩只試管作為供試品試管。在從剩下的兩只試管中取其中的任意一只加入2A內(nèi)毒素工作標準品溶液0.1ml作為陽性對照管，在最后剩下的一只試管中加入細菌內(nèi)毒素檢查用水0.1ml作為陰性對照管。將試管混勻封口后放在（36-38）℃的水浴中保溫1小時，然后取出慢慢倒轉(zhuǎn)180°并對試管進行觀察，如果試管內(nèi)的凝膠附著在試管壁上沒有明顯的改變則記為陽性（+），如若不然則為陰性（-）。供試品兩個試管都是陰性才符合規(guī)定。

3 細菌內(nèi)毒素檢查法在藥用原料、注射制劑方面的探究與研討

3.1 在化學藥品方面的探究與研討

《中國藥典》中有用細菌內(nèi)毒素檢查法（BET法）檢查熱原的藥品有73個品種的原料藥及其注射劑共205個。并且在之前的部分相關(guān)報道中說可以用BET法檢查化學原料藥及注射制劑中的熱原有卡鉑原料藥、五種氨基酸原藥、三磷酸胰苷二鈉注射液、注射用脫氧核糖核酸等四十余種。在臨床醫(yī)學中如果有氰化物、硝酸、亞硝酸鹽中毒現(xiàn)象發(fā)生，同上會選擇亞甲藍注射液來解毒，他的細菌內(nèi)毒素的含量是影響該藥品質(zhì)量的重要指標。相關(guān)研究人士用動態(tài)比濁法對亞甲藍注射液和低分子量肝素鈣注射液進行相關(guān)的測定，并將測定的結(jié)果與凝膠法得出的結(jié)果相對比，發(fā)現(xiàn)亞甲藍注射液的濃度為0.125mg/ml時并沒有產(chǎn)生太大的干擾，所得到的數(shù)據(jù)是10mg/ml的樣品的細菌內(nèi)毒素均<0.25EU/ml；低分子量肝素鈣注射液稀釋到12.5IU/ml時對試驗沒有任何的干擾作用，當對樣品進行細菌內(nèi)毒素含量的檢查時，發(fā)現(xiàn)其含量均<0.01IU/ml，與凝膠法測的結(jié)果基本一致，所以就得出這兩個品種可以用細菌內(nèi)毒素檢查法。

3.2 在中藥試劑方面的探究與研討

在當下的國家標準中，明確指出有四個化學藥注射劑（含中藥成分）規(guī)定用細菌內(nèi)毒素檢查法來代替PT法。有的文獻指出，金葉敗毒注射液、舒血寧注射液、燈盞花素注射液等近20個品種都是細菌內(nèi)毒素檢查法的中藥注射劑的成分。有些有識之士認為可以在國家標準的基礎(chǔ)上對紫杉醇注射液用細菌內(nèi)毒素檢查法在進行相關(guān)的測定，以確定紫杉醇注射液的內(nèi)毒素L不干擾試驗的濃度。經(jīng)過試驗證明現(xiàn)在國家標準中所確定的內(nèi)毒素的含量L=0.4EU/ml不能改變，三批紫杉醇注射液的干擾試驗0.075mg/ml是符合要求的。但是也有一部分有識之士認為可以通過半定量法去計算生脈注射液中細菌內(nèi)毒素的含量，覺得該藥品可以用細菌內(nèi)毒素檢查法去探究。

4 細菌內(nèi)毒素檢查法的應(yīng)用

凝膠法最早是由美國藥典在1980年進行相關(guān)論述，并把這個方法作為仲裁法在美國、歐洲、日本等多個國家進行藥品的檢驗。在其后動態(tài)濁度法、顯色基質(zhì)法、電泳法、酶聯(lián)免疫等都有了很快的發(fā)展，它的優(yōu)勢就在于降低了無關(guān)干擾并且檢查的速度相對來說是比較快的。在不斷發(fā)展的自動化現(xiàn)代社會，各個國家都開始使用儀器自動化檢測并用儀器對實驗數(shù)據(jù)做出相應(yīng)的分析和總結(jié)。此外，細菌內(nèi)毒素檢驗所用的試劑量和樣品量的要求在不斷地降低，所用的鱟試劑也是少之又少，并且有很好的靈敏度和抗干擾的能力。

5 總結(jié)

細菌內(nèi)毒素檢查法在我國藥品檢驗中是一項非常重要的質(zhì)控技術(shù)，許多國家也在此領(lǐng)域展開了新的探索，以前對熱原檢查沒有做出相關(guān)要求的品種也在逐步開始使用細菌內(nèi)毒素檢查法進行檢驗，雖然我國在細菌內(nèi)毒素檢查法方面的成就還存在一定的缺陷也不是特別突出，但是我們國家也在不斷地突破和創(chuàng)新，為我國的藥品檢驗做出了巨大的貢獻。

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