致病性熒光假單胞菌FK-1的分離鑒定及其感染草魚(yú)后免疫因子的變化研究

張志鵬， 王 會(huì)， 閻 華， 黃升謀， 李云捷， 吳進(jìn)菊， 于 博， 李玉奇

(1.湖北文理學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北襄陽(yáng) 441053； 2.湖北省襄陽(yáng)市中心醫(yī)院，湖北襄陽(yáng) 441053)

草魚(yú)屬鯉形目鯉科雅羅魚(yú)亞科草魚(yú)屬，棲息于平原地區(qū)的江河湖泊，一般喜居于水的中下層和近岸多水草區(qū)域，性活潑，游泳迅速，常成群覓食，為典型的草食性魚(yú)類。草魚(yú)幼魚(yú)期擇食幼蟲(chóng)、藻類等，草魚(yú)也吃一些葷食，如蚯蚓、蜻蜓等。在干流或湖泊的深水處越冬，生殖季節(jié)親魚(yú)有溯游習(xí)性，因其生長(zhǎng)迅速，飼料來(lái)源廣，是中國(guó)淡水養(yǎng)殖的四大家魚(yú)之一，分布于中國(guó)各大水系，肉味美、魚(yú)膽有毒。由于草魚(yú)的高密度養(yǎng)殖，高蛋白飼料投喂易造成水環(huán)境惡化，同時(shí)許多養(yǎng)殖場(chǎng)忽視了防病措施，傳染性疾病日趨嚴(yán)重，發(fā)病率高達(dá)70%以上，造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。近期廣東地區(qū)一些養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)草魚(yú)疾病，其體表出現(xiàn)潰瘍，嚴(yán)重者口鼻充血、流血，解剖后內(nèi)臟肝、脾、腎腫大。經(jīng)過(guò)細(xì)菌分離鑒定是熒光假單胞菌的大量感染，熒光假單胞菌分類學(xué)上屬于細(xì)菌域、變形菌門(mén)、γ-變形菌綱、假單胞菌目、假單胞菌科的假單胞菌屬。細(xì)胞為直的桿菌，不產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色陰性，有數(shù)根極生鞭毛，運(yùn)動(dòng)；需氧，進(jìn)行嚴(yán)格的呼吸型代謝，以氧為最終電子受體，能以硝酸鹽為替代的電子受體進(jìn)行厭氧呼吸；化能營(yíng)養(yǎng)異養(yǎng)，不需要有機(jī)生長(zhǎng)因子；氧化酶陽(yáng)性，接觸酶陽(yáng)性。能利用葡萄糖和果糖，有些菌株能從蔗糖合成果聚糖[1]。廣泛分布于自然界，如土壤、水、植物及動(dòng)物活動(dòng)環(huán)境中。草魚(yú)血液中鐵元素參與諸多代謝途徑，也是免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用的重要因子，可影響巨噬細(xì)胞的殺菌功能以及免疫細(xì)胞的增殖和活性。同時(shí)，鐵元素也是病原微生物和宿主相互競(jìng)爭(zhēng)的對(duì)象，機(jī)體可以通過(guò)調(diào)節(jié)鐵元素相關(guān)基因，一定程度上抑制病原微生物的侵害。Hepcidin基因(hepc)是一種主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生的防御性抗菌肽，屬于防御素蛋白家族，具有抑菌活性，同時(shí)也是機(jī)體鐵元素代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對(duì)維持鐵元素平衡具有重要作用，俗稱鐵調(diào)素[2]。白細(xì)胞介素6(il-6)炎癥因子能強(qiáng)烈地刺激鐵調(diào)素的表達(dá)，而il-6炎性因子是通過(guò)刺激JAK/STAT(蛋白酪氨酸激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子)信號(hào)通路調(diào)節(jié)鐵調(diào)素表達(dá)[3]。本試驗(yàn)通過(guò)草魚(yú)源熒光假單胞菌FK-1的分離鑒定，進(jìn)而檢測(cè)侵染熒光假單胞菌FK-1后對(duì)草魚(yú)鐵元素代謝水平和肝臟中hepc、il-6、jak3和stat3基因表達(dá)量變化趨勢(shì)，研究熒光假單胞菌FK-1侵染和機(jī)體鐵元素代謝之間的相互作用，為進(jìn)一步研究鐵元素相關(guān)基因在受感染草魚(yú)應(yīng)對(duì)細(xì)菌侵染中的作用提供科學(xué)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 染病草魚(yú)采集與病原菌的分離

2016年8月，廣東省佛山市順德區(qū)大良鎮(zhèn)某漁場(chǎng)草魚(yú)暴發(fā)疾病，出現(xiàn)大量死魚(yú)。人工收集染病草魚(yú)，肉眼觀察這些死魚(yú)患典型敗血癥，其主要癥狀為口鼻充血、出血，魚(yú)鱗片出現(xiàn)脫落、有血絲。將死魚(yú)低溫冷藏運(yùn)回廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室，解剖后可見(jiàn)死魚(yú)肝臟腫大、點(diǎn)狀出血、腎臟和腸道充血。在無(wú)菌條件下，從染病草魚(yú)的肝、腎、皮膚、血液取樣，營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板劃線分離，30 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落純化培養(yǎng)，菌株低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)菌鑒定

經(jīng)細(xì)菌形狀、革蘭氏染色和氧化酶檢測(cè)，采用法國(guó)梅里埃生物公司革蘭氏陰性或陽(yáng)性鑒定試劑條，VITEK-32全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定[4]。

1.3 試驗(yàn)用健康草魚(yú)

試驗(yàn)用健康草魚(yú)，購(gòu)自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，選取外觀健康、大小基本一致的草魚(yú)幼魚(yú)，魚(yú)體質(zhì)量為(200±5) g、體長(zhǎng)為(25±1) cm。將試驗(yàn)魚(yú)隨機(jī)分為2個(gè)處理組：試驗(yàn)組和對(duì)照組，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行組50尾魚(yú)，共300尾。

1.4 熒光假單胞菌FK-1侵染和樣品采集

根據(jù)前期試驗(yàn)，確定熒光假單胞菌FK-1侵染的最適菌懸液濃度為 1.0×107CFU/mL。將30 ℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng)的熒光假單胞菌FK-1用0.65%無(wú)菌生理鹽水洗脫，稀釋成 1.0×107CFU/mL 的菌懸液，采用腹腔注射法，注射前試驗(yàn)魚(yú)用200 mg/L乙醇輕度麻痹，試驗(yàn)組每尾注射0.1 mL的菌懸液，對(duì)照組注射等量的無(wú)菌生理鹽水。注射后6、12、24、48、72、84、96 h分別采集試驗(yàn)組和對(duì)照組魚(yú)的肝臟和機(jī)體，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)平行取3尾魚(yú)，將一次性1 mL注射器用肝素鈉(1 000 IU/mL)潤(rùn)洗，從魚(yú)體尾靜脈取血0.5～0.8 mL。采血后立即解剖，取出肝臟組織置于液氮中，之后于-80 ℃保存，用于后面的肝臟鐵含量和基因表達(dá)測(cè)定。

1.5 血清鐵濃度、總鐵結(jié)合力的測(cè)定

血清樣品制備：采取的血液于40 ℃靜置2 h左右，以 4 000 r/min 離心10 min后收集上層血清，-20 ℃冰箱過(guò)夜，次日血清解凍后再次低速度離心，4 000 r/min離心10 min，吸取上層液-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

血清鐵濃度及總鐵結(jié)合力(mg/L)的測(cè)定使用血清鐵、總鐵結(jié)合力試劑盒(深圳市紅瑞生物工程有限公司)。血清鐵濃度的檢測(cè)原理為，在酸性溶液和還原劑的作用下，使轉(zhuǎn)鐵蛋白中鐵與蛋白分離，使血清中高鐵還原成亞鐵，后者與雙吡啶結(jié)合成粉紅色的絡(luò)合物，在一定范圍內(nèi)，鐵離子的濃度與吸光度成正比?？傝F結(jié)合力的檢測(cè)原理為[4]，血清內(nèi)加入過(guò)量的鐵，使血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白全部與鐵結(jié)合，再加入鐵吸附劑將多余的鐵吸附掉。然后依據(jù)血清鐵檢測(cè)方法測(cè)定鐵含量，即總鐵結(jié)合力。測(cè)定步驟具體參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，利用紫外分光光度計(jì)(TU-1900，北京普析通用儀器有限公司)測(cè)定，每一樣品重復(fù)檢測(cè)3次。

1.6 肝臟鐵濃度的測(cè)定

采用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP-AES)檢測(cè)肝臟鐵含量[5]，步驟如下：將肝臟樣品解凍后，用冷生理鹽水沖洗干凈并用濾紙吸干后稱質(zhì)量，粉碎均勻后置于瓷坩鍋中，在電爐上炭化完全，無(wú)煙為止，置于馬弗爐內(nèi)，經(jīng)600 ℃灼燒5 h，直至試樣呈白色或者灰白色、無(wú)炭粒為止。冷卻后取出，用 1 ∶1 的硝酸5 mL溶解，電爐上加熱直至沸騰為止，過(guò)濾至 50 mL 容量瓶，并用雙蒸水反復(fù)洗滌坩堝和濾紙，洗滌液并入容量瓶中，然后用雙蒸水定容，混勻，作為試樣溶液。同時(shí)配制試劑空白液。采用ICP-AES儀(ICP-3600，上海精密科學(xué)儀器有限公司)測(cè)定，每一樣品重復(fù)檢測(cè)3次。

1.7 肝臟鐵代謝相關(guān)基因表達(dá)特征分析

根據(jù)草魚(yú)hepc基因cDNA序列(FC398254)、il-6基因cDNA序列(KL734254)，jak3基因cDNA序列(LQ543282)、草魚(yú)stat3基因cDNA序列(NM916923)設(shè)計(jì)引物(表2)[6-8]。采用RNAiso(大連寶生物工程有限公司)提取肝臟總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)說(shuō)明書(shū)在實(shí)時(shí)定量?jī)x(T-100，美國(guó)伯樂(lè)儀器有限公司)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。目的基因在肝臟中的相對(duì)表達(dá)量采用2分對(duì)照法確定，選擇草魚(yú)18S rRNA基因作為內(nèi)參(BF264255)[9]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：0.4 μL上下游引物，2.0 μL cDNA模板，7.2 μL ddH2O，總體積20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性 5 s，60 ℃退火20 s，72℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)，溶解曲線溫度從52 ℃至99℃，每一樣品重復(fù)檢測(cè)3次。

表2 草魚(yú)鐵代謝相關(guān)基因熒光定量PCR引物序列

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)利用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t-檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著[10]。所有數(shù)值均為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落特征

從染病草魚(yú)肝臟中分離出1株菌株FK-1，24 h營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)物為黃色、濕潤(rùn)圓形略隆起、邊緣整齊，直徑2 mm左右，革蘭色染色為陰性桿菌(圖1)。

2.2 生化反應(yīng)及鑒定結(jié)果

菌株FK-1經(jīng)純化分離后，采用VITEK-32全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定結(jié)果為熒光假單胞菌，其生理、生化特性見(jiàn)表3。

2.3 熒光假單胞菌FK-1侵染草魚(yú)后其血清鐵濃度變化

熒光假單胞菌FK-1侵染草魚(yú)后不同時(shí)間點(diǎn)血清中鐵濃度的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖2。細(xì)菌侵染后不同時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)組草魚(yú)的血清鐵濃度與對(duì)照組相比均有不同程度降低，侵染后 24 h 和48 h后達(dá)到顯著水平(P<0.05〉，隨后血清鐵濃度有所上升，但仍低于對(duì)照組。

表3 菌株FK-1生理生化特性

2.4 熒光假單胞菌FK-1侵染草魚(yú)后對(duì)其血清總鐵結(jié)合力的變化

熒光假單胞菌FK-1侵染草魚(yú)后不同時(shí)間點(diǎn)其血清中總鐵結(jié)合力的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖3。試驗(yàn)組草魚(yú)血液中血清的總鐵結(jié)合力相對(duì)于對(duì)照組略有增加，但均未達(dá)到顯著性水平。

2.5 熒光假單胞菌FK-1侵染草魚(yú)后其不同時(shí)間點(diǎn)肝臟鐵含量的變化

由圖4可見(jiàn)，熒光假單胞菌FK-1侵染草魚(yú)后不同時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)組肝臟鐵含量均高于對(duì)照組，但并無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.6 熒光假單胞菌FK-1侵染草魚(yú)后對(duì)其不同時(shí)間點(diǎn)hepc、il-6、jak3、stat3基因表達(dá)的影響

由圖5可見(jiàn)，在注射熒光假單胞菌FK-1后，hepc基因在不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量相對(duì)于0 h明顯上調(diào)，在6、12、24 h達(dá)到顯著性差異(P<0.05)，在侵染后6 h達(dá)到最高，隨后逐漸下降。基因il-6在侵染后表達(dá)量明顯上調(diào)，在24 h時(shí)表達(dá)量最高，隨后有所下降，在12、24、48 h均達(dá)到了顯著性差異(P<0.05)；基因jak3和stat3的表達(dá)量亦均有所上調(diào)，jak3基因在12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高(P<0.05)，stat3基因在6 h時(shí)的表達(dá)量達(dá)到最高，隨后逐步下降，但仍明顯高于侵染前的表達(dá)水平。

3 討論

從染病草魚(yú)中取樣進(jìn)行細(xì)菌的劃線分離、純化，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上獲得菌落形態(tài)完全一致、有典型致病力的菌株，將該菌株編號(hào)為FK-1。全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定結(jié)果為嗜溫?zé)晒饧賳伟＞闒K-1人工感染草魚(yú)試驗(yàn)，出現(xiàn)的癥狀與自然病例基本相同，再鑒定的菌株與接種菌株完全一致，所觀察到的菌落形態(tài)也基本相符。該菌能廣泛地侵襲健康草魚(yú)腎、脾、肺、肝、肌肉和血液等器官組織，大量增殖，造成廣泛性出血，全身性組織損害，各器官組織出現(xiàn)腫脹、顆粒變性、玻璃樣變、壞死崩解以及紅細(xì)胞碎裂。染病草魚(yú)解剖后觀察均可見(jiàn)體表出現(xiàn)潰瘍、疤痕，嚴(yán)重的產(chǎn)生口鼻充血、流血，內(nèi)臟肝、脾、腎腫大，腸道充血，嚴(yán)重者有腹水。

草魚(yú)血液中鐵元素是機(jī)體多種酶類合成的必需元素，參與氧氣運(yùn)輸、細(xì)胞增殖和分化、電子轉(zhuǎn)移等多種生命活動(dòng)。鐵元素也是需鐵細(xì)菌增殖分化的必要成分，并且對(duì)致病菌毒力的強(qiáng)弱也會(huì)產(chǎn)生重要影響。細(xì)菌入侵后通過(guò)攝取宿主機(jī)體的鐵元素以滿足其增殖和致病力的表達(dá)。宿主通過(guò)降低機(jī)體的鐵元素代謝水平，在一定程度上可以抑制細(xì)菌增殖并降低其致病力。本試驗(yàn)結(jié)果表明，草魚(yú)感染熒光假單胞菌FK-1后血清鐵元素含量有所下降，并在侵染后24、48 h達(dá)到顯著性水平。肝臟鐵含量在侵染后有所上升，但沒(méi)有達(dá)到顯著性水平。這可能與機(jī)體在侵染后通過(guò)一系列自我調(diào)節(jié)，降低機(jī)體的鐵元素代謝以抑制細(xì)菌的侵害以及細(xì)菌在機(jī)體迅速增殖消耗大量鐵元素有關(guān)。草魚(yú)感染熒光假單胞菌FK-1后的血清總鐵結(jié)合力相對(duì)于對(duì)照組有所上升，雖沒(méi)有達(dá)到顯著性水平，但結(jié)合細(xì)菌侵染后魚(yú)體血清鐵元素含量的變化趨勢(shì)和轉(zhuǎn)鐵蛋白的上調(diào)，可以認(rèn)為血清鐵元素和轉(zhuǎn)鐵蛋白的比率顯著下降，進(jìn)一步提高了鐵與轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)合效率，有利于抑制熒光假單胞菌FK-1從機(jī)體攝取鐵元素的能力。

本試驗(yàn)中所檢測(cè)的草魚(yú)肝臟hepc、il-6、jak3和stat3基因在熒光假單胞菌FK-1侵染后6、12 h都有不同程度的顯著上調(diào)，表明這些基因都參與了魚(yú)體的非特異性免疫反應(yīng)，同時(shí)這些基因也不同程度地參與了細(xì)菌侵染后的鐵元素相關(guān)基因調(diào)節(jié)。hepc基因主要在肝臟中合成和分泌，可以抑制腸道鐵元素的吸收和肝臟鐵元素的釋放以降低機(jī)體的鐵元素相關(guān)基因水平，是機(jī)體調(diào)節(jié)鐵相關(guān)基因的關(guān)鍵因素。前人研究證實(shí)，大菱鲆在感染細(xì)菌熒光假單胞菌FK-1后，肝、脾、鰓等組織中hepc基因的表達(dá)量均顯著增高。感染鏈球菌后，鱸魚(yú)肝細(xì)胞hepcmRNA水平在數(shù)小時(shí)內(nèi)明顯上調(diào)。鯽魚(yú)肝臟中hepc基因表達(dá)量在感染鰻利斯頓氏菌后顯著上升[11-12]。本試驗(yàn)中，hepc基因在侵染后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均有所上升，并在12、24 h達(dá)顯著差異。草魚(yú)機(jī)體受熒光假單胞菌侵害時(shí)，巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞會(huì)合成和分泌大量的炎癥因子，其中主要為白細(xì)胞介素6(il-6)，炎癥反應(yīng)可通過(guò)一系列生化過(guò)程調(diào)節(jié)hepc基因的表達(dá)，進(jìn)而影響機(jī)體鐵元素相關(guān)基因水平。il-6和受體結(jié)合后可激活jak3基因，進(jìn)而磷酸化stat3，進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)hepc基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)hepc基因的表達(dá)。本試驗(yàn)中，在草魚(yú)感染熒光假單胞菌FK-1后各時(shí)間點(diǎn)草魚(yú)肝臟中il-6的表達(dá)量均有所上升，在24 h達(dá)到最高，隨后有所下降，但仍明顯高于0 h的表達(dá)量?；騤ak3和stat3的表達(dá)量也均有所上調(diào)，分別在6、12 h達(dá)到最高，隨后有所下降，可以推測(cè)，當(dāng)熒光假單胞菌FK-1侵染草魚(yú)時(shí)，引起機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)，在il-6基因和JAK/STAT通路相關(guān)基因的影響下，hepc基因的表達(dá)量上升，進(jìn)而下調(diào)機(jī)體的循環(huán)鐵元素濃度，以應(yīng)對(duì)細(xì)菌的侵害。