副干酪乳桿菌FM-LP-4菌株的高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化

王 英， 周劍忠， 施亞萍， 夏秀東， 董 月， 黃自蘇

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014； 2.南京市脆而爽蔬菜食品有限公司，江蘇南京 211225)

細胞高密度培養(yǎng)(high-cell density cultivation，簡稱HCDC)技術(shù)是直投式發(fā)酵劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的一個關(guān)鍵技術(shù)。營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子、代謝產(chǎn)物、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、溶氧等環(huán)境因素都可能影響細胞的高密度培養(yǎng)。目前國內(nèi)外對菌體的高密度培養(yǎng)有大量的研究，主要集中在培養(yǎng)基篩選、配方優(yōu)化和培養(yǎng)條件優(yōu)化等方面[1-7]。

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)是一種兼性厭氧、不運動、無芽孢的桿菌或長桿菌。研究表明，副干酪乳桿菌作為益生菌在增強人體免疫功能、調(diào)節(jié)人體腸道菌群平衡、預(yù)防疾病等方面有著廣闊的發(fā)展前景[8-10]。副干酪乳桿菌FM-LP-4來源于新疆駱駝酸奶，它具有較高的體內(nèi)、體外抗氧化活性[11]，且具有較強的適應(yīng)環(huán)境能力和較好的加工屬性，這些特性使其具有良好的應(yīng)用前景。若要實現(xiàn)副干酪乳桿菌的工業(yè)化應(yīng)用，須將該菌株制備成直投式發(fā)酵劑，而直投式發(fā)酵劑制備的關(guān)鍵是保證并提高菌種的活力和活菌數(shù)。根據(jù)副干酪乳桿菌FM-LP-4的生長需求，本研究從增殖培養(yǎng)基篩選和發(fā)酵條件2個方面進行研究，確定優(yōu)化培養(yǎng)基配方和適宜的培養(yǎng)條件，為副干酪乳桿菌FM-LP-4直投式發(fā)酵劑的制備和產(chǎn)品開發(fā)提供試驗依據(jù)，為其工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株資源

副干酪乳桿菌FM-LP-4保存于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所。

1.2 培養(yǎng)基

MRS(de Man,Rogosa and Sharpe)液體培養(yǎng)基：2.000%葡萄糖、1.000%蛋白胨、1.000%牛肉膏、0.500% 酵母粉、0.500%乙酸鈉、0.200%磷酸氫二鉀、0.200%檸檬酸氫二銨、0.058%硫酸鎂、0.020%硫酸鎂、0.100%吐溫-80。

UMRS(Unnormal de Man,Rogosa and Sharpe)液體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中不添加碳源和氮源，配方為0.500%乙酸鈉、0.200%磷酸氫二鉀、0.200%檸檬酸氫二銨、0.058%硫酸鎂、0.020%硫酸鎂、0.100% 吐溫-80，以上培養(yǎng)基在溫度為121 ℃條件下、滅菌20 min。

1.3 主要設(shè)備及其來源

1.3.1 主要試劑與設(shè)備 主要試劑有1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，簡稱DPPH)，購自南京天為生物科技有限公司；吡咯烷二硫代氨基甲酸銨、鄰菲羅啉，購自中國醫(yī)藥集團上海化學(xué)試劑公司；對氨基苯磺酸、鹽酸奈乙二胺、亞硝酸鈉及其他所用化學(xué)試劑均為分析純級化學(xué)試劑，購自南京卓越生物工程有限公司。

主要設(shè)備有UV-1600PC紫外分光光度計，購自上海美普達儀器有限公司；YQX-11厭氧培養(yǎng)箱，購自上海躍進醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1C型雙人單面凈化工作臺，購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；SIGMA3K-15臺式冷凍離心機，購自北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；124S-CW分析天平，購自賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；TOMY SX500自動滅菌鍋，購自日本Tomy Digital Biology公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 培養(yǎng)條件優(yōu)化 溫度對FM-LP-4菌株生長的影響。挑取FM-LP-4菌株單菌落接種于MRS液體試管中，在溫度為 37 ℃ 條件下培養(yǎng)20 h，然后2%接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，分別于溫度為15、20、25、30、35、40 ℃下培養(yǎng)20 h，測定菌液的D600 nm，每組3個平行試驗。

pH值對FM-LP-4菌株生長的影響。以1 mol/LHCL和NaOH調(diào)解MRS液體培養(yǎng)基pH值分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，按2%接種量接種FM-LP-4菌株的新鮮菌液，于溫度為37 ℃下培養(yǎng)20 h，測定菌液的D600 nm，每組3個平行試驗。

裝液量對FM-LP-4生長的影響。50 mL三角瓶中培養(yǎng)基裝液量分別為10、20、30、40、50 mL，按2%接種量接種FM-LP-4菌株的新鮮菌液，于溫度為37 ℃條件下培養(yǎng) 20 h，測定菌液的D600 nm，每組3個平行試驗。

接種量對FM-LP-4菌株生長的影響。接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下培養(yǎng)20 h，測定菌液的D600 nm，每組3個平行試驗。

培養(yǎng)條件正交優(yōu)化?？紤]到幾種增殖因素之間可能存在聯(lián)合協(xié)同作用，選定在單因素試驗中以培養(yǎng)溫度、接種量、初始pH值為重要的培養(yǎng)環(huán)境因素，利用L9(34)正交試驗優(yōu)化FM-LP-4菌株的培養(yǎng)條件。

表1 單因素試驗的因素水平

1.4.2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化 碳源對FM-LP-4菌株生長的影響。在UMRS液體培養(yǎng)基上，分別以葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、甘露糖為碳源，添加量為2%；氮源按照MRS培養(yǎng)基中的配方添加。按照2%接種量接種于液體培養(yǎng)基中，在34 ℃條件下培養(yǎng)20 h，每組3個平行試驗，測定發(fā)酵液體的D600 nm。

碳源含量對FM-LP-4菌株生長的影響。在研究碳源影響的基礎(chǔ)上，對所選碳源的濃度進行單因素試驗，按照濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%配制MRS培養(yǎng)基，其他成分不變。按照2%接種量接種于液體培養(yǎng)基中，在34 ℃條件下靜止培養(yǎng)20 h，每組3個平行試驗，測定發(fā)酵液體的D600 nm。

氮源對FM-LP-4菌株生長的影響。在UMRS液體培養(yǎng)基上，選擇蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、酪蛋白胨、魚蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉作為氮源，添加量為2%，碳源按照MRS培養(yǎng)基中的配方添加。按2%接種量接于UMRS液體培養(yǎng)基中，在34 ℃條件下靜止培養(yǎng)20 h，每組3個平行試驗，測定發(fā)酵液體的D600 nm。

氮源含量對FM-LP-4菌株生長的影響。在研究氮源影響的基礎(chǔ)上，對所選氮源的濃度進行單因素試驗，按照濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%配制MRS培養(yǎng)基，其他成分不變。按照2%接種量接種于液體培養(yǎng)基中，在34 ℃條件下靜止培養(yǎng)20 h，每組3個平行試驗，測定發(fā)酵液體的D600 nm。

不同營養(yǎng)因子對FM-LP-4菌株生長的影響。選擇包菜汁、番茄汁、胡蘿卜汁、青辣椒汁、白菜汁、黃瓜汁作為營養(yǎng)因子，以不添加任何生長因子的MRS為空白對照，質(zhì)量分數(shù)均為5%。按照2%接種量接種于液體培養(yǎng)基中，在34 ℃條件下靜止培養(yǎng)20 h，每組3個平行試驗，測定發(fā)酵液體的D600 nm。以MRS液體培養(yǎng)基作為對照組。

培養(yǎng)基正交優(yōu)化?？紤]到幾種增殖因素之間可能存在聯(lián)合協(xié)同的交互作用，選定在單因素試驗中增殖效果較明顯的幾種增殖因素(葡萄糖、胰蛋白胨、番茄汁)進行L9(34)正交試驗，其他成分按照MRS培養(yǎng)基中的含量進行配比。優(yōu)化FM-LP-4菌株的增殖培養(yǎng)基。

表2 因素水平

1.5 驗證試驗

按照正交試驗結(jié)果配制優(yōu)化的培養(yǎng)基，進行接種FM-LP-4菌株培養(yǎng)，測定D600 nm，重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析；數(shù)據(jù)間差異比較采用t檢驗，差異顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對FM-LP-4菌株生長的影響

由圖1可以看出，隨著溫度的升高，F(xiàn)M-LP-4菌株的菌體密度呈先升高后降低的趨勢，在溫度為34 ℃時，菌體密度最高，因此，F(xiàn)M-LP-4菌株的適宜生長溫度在34 ℃左右。

2.2 初始pH值對FM-LP-4菌株生長的影響

培養(yǎng)基的初始pH值對菌體的生長也有重要的影響，合適的pH值能縮短菌體的延滯期，較快地進入菌株對數(shù)生長期。由圖2可知，MRS的初始pH值為6.5時，在相同的生長時間，菌體密度最高。因此，最適的初始pH值為6.5。

2.3 接種量對FM-LP-4菌株生長的影響

接種量較低會延長菌體的延滯期，接種量較高菌體會較快進入對數(shù)生長期，進而較快進入菌體穩(wěn)定期，在穩(wěn)定期菌體容易發(fā)生自溶現(xiàn)象，進而降低菌體密度。因此，合適的接種量也是菌體高密度培養(yǎng)的一個重要條件。由圖3可以看出，隨著接種量的增加，菌體密度呈現(xiàn)先增加后緩慢降低的趨勢，接種量為4%時菌體密度達到最大值，但接種量為3%～5%時，菌體密度沒有顯著(P>0.05)區(qū)別，因此選擇4%為最適接種量。

2.4 裝液量對FM-LP-4菌株生長的影響

一般乳酸菌均是兼性厭氧型，環(huán)境的氧含量對菌株的生長有明顯的影響。本研究利用50 mL三角瓶，裝不同含量的MRS液體培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)相同時間，檢測FM-LP-4菌株的菌體密度。由圖4可以看出，隨著裝液量的增加，F(xiàn)M-LP-4菌株密度升高，在裝液量為40 mL條件下，菌體密度達到最高，但與裝液量為50 mL的三角瓶中的菌體密度沒有顯著差異(P>0.05)，為操作方便，選擇80%為最適裝液量。

2.5 FM-LP-4菌株培養(yǎng)條件正交優(yōu)化

考慮到因素之間可能存在聯(lián)合協(xié)同的交互作用，選定在單因素試驗中培養(yǎng)溫度、接種量、初始pH值為3個主要因素，利用L9(34)正交試驗優(yōu)化FM-LP-4菌株的培養(yǎng)條件。由表3可以看出，3個因素對FM-LP-4菌株活菌增殖量的影響順序為A>C>B，即影響FM-LP-4菌株生長發(fā)育的最主要環(huán)境因素是培養(yǎng)溫度，其次是初始pH值。確定最佳增殖培養(yǎng)條件為A2B1C3，即培養(yǎng)溫度為34 ℃、接種量為3%、初始pH值為6.8。

2.6 不同碳源對FM-LP-4菌株生長的影響

培養(yǎng)基中碳源和氮源成分及其適宜添加量的選擇一直是改善乳酸菌生長的手段[12-13]，經(jīng)常使用增菌培養(yǎng)基包括配制培養(yǎng)基(如MRS、M17等)、乳基質(zhì)培養(yǎng)基、乳清基質(zhì)培養(yǎng)基等，其中，乳基質(zhì)培養(yǎng)基、乳清基質(zhì)培養(yǎng)基比較適合乳酸菌的生長，生長達到穩(wěn)定期的乳酸菌的菌體密度較高，但因其增殖慢或不易分離菌體而不宜采用。乳酸菌增殖培養(yǎng)基應(yīng)具有以下2個特點：(1)適合菌體生長、繁殖速度快，在較短時間內(nèi)可以得到大量高活力細胞；(2)菌體與培養(yǎng)基易分離、成本低廉[14-15]。因此，研究選擇以MRS為基本培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上改變碳源、氮源，進而篩選合適的碳源和氮源。另外有研究報道，在MRS培養(yǎng)基中添加蔬菜汁能夠改善乳酸菌的生長，增加菌體密度，因此，本研究選擇一些常見蔬菜汁進行試驗，目的是能夠增加FM-LP-4菌株的菌體密度，為FM-LP-4菌株直投發(fā)酵劑的開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

表3 FM-LP-4菌株培養(yǎng)基條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果

本研究選擇乳酸桿菌屬生長比較容易利用的葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、甘露糖為碳源，這些碳源在市場上容易買到。由圖5可知，不同碳源對FM-LP-4菌株生長的影響差別很大，其中以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中 FM-LP-4 菌株的菌體密度最高，生長20 h時，D600 nm值達到2.14，其次是果糖，D600 nm值為2.09，以甘露糖為碳源的培養(yǎng)基中 FM-LP-4 菌株菌體密度最低，D600 nm僅為1.70，比以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基菌體D600 nm值低0.44，因此，選擇葡萄糖為 FM-LP-4 菌株適宜生長碳源。

2.7 葡萄糖不同含量對FM-LP-4菌株生長的影響

添加合適量的碳源對菌體生長有很大的影響，較低的碳源含量不足以支持菌體的生長，高含量的碳源會增加培養(yǎng)液的滲透壓，不利于菌體的生長。由圖6可知，隨著碳源含量的增加，菌體密度開始呈現(xiàn)增長趨勢，當(dāng)葡萄糖含量為3%時，菌體密度達到最高，但與4%葡萄糖含量的菌體密度差異不顯著(P>0.05)，隨著碳源含量的繼續(xù)增加，菌體密度又呈下降趨勢，因此，葡萄糖最適的添加量為3%。

2.8 不同氮源對FM-LP-4菌株生長的影響

選擇蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、魚蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉等氮源作為篩選適合FM-LP-4生長的氮源。由圖7可知，有機氮源更適合FM-LP-4菌株的生長，在有機氮源中，以胰蛋白胨的促生長效果最明顯，牛肉膏次之。因為牛肉膏中含有肌酸、肌酸酐、氨基酸類、核苷酸類、有機酸類、礦物質(zhì)類及維生素類的水溶性物質(zhì)，能夠為乳酸菌生長提供多種營養(yǎng)物質(zhì)，因此，對于氮源來說，選擇胰蛋白胨和牛肉膏為復(fù)合氮源，其中，添加牛肉膏的含量按照MRS基本培養(yǎng)基的添加量進行，因為其除了作為氮源來源，還提供其他的營養(yǎng)成分。

2.9 胰蛋白胨不同含量對FM-LP-4菌株菌體密度的影響

添加合適量的氮源對菌體生長有很大的影響，較低的氮源含量不足以支持菌體的生長，高含量的氮源會增加培養(yǎng)液的滲透壓，不利于菌體的生長。由圖8可知，隨著胰蛋白胨含量的增加，菌體密度先呈上升趨勢，當(dāng)胰蛋白胨含量為3%時，菌體密度達到最高，隨著胰蛋白胨含量的進一步增加，菌體密度呈下降趨勢，因此，胰蛋白胨最適的添加量為3%。

2.10 不同蔬菜汁對FM-LP-4菌株生長的影響

在乳酸菌高密度培養(yǎng)基的篩選和優(yōu)化研究中，除了對氮源和碳源進行優(yōu)化研究外，蔬菜汁對乳酸菌增殖的影響也有大量研究，葛宗昌等研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯汁能促進干酪乳桿菌的生長[16]。本研究選擇包菜汁、番茄汁、胡蘿卜汁、青辣椒汁、白菜汁、黃瓜汁作為營養(yǎng)因子，檢測不同的蔬菜汁對FM-LP-4菌株生長的影響。由圖9可知，在MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加不同的蔬菜汁，菌體密度呈不同的變化，其中，番茄汁對FM-LP-4菌株的增殖效果最好，MRS基本培養(yǎng)基中FM-LP-4菌株的D600 nm為1.992，含有番茄汁的FM-LP-4菌株的D600 nm高達2.213；其次是胡蘿卜汁，D600 nm高達2.194，可見不同的菌株對蔬菜汁的響應(yīng)是不同的，因此，選擇番茄汁為最適的營養(yǎng)增殖因子。

2.11 番茄汁不同添加量對FM-LP-4菌株生長的影響

由圖10可知，隨著番茄汁添加量的增加，菌體密度開始逐漸增加，但增加到一定程度，增加效果不再明顯，考慮到經(jīng)濟成本，選擇合適的添加量為6%。

2.12 FM-LP-4菌株增殖培養(yǎng)基正交優(yōu)化

幾種增殖因素之間可能存在聯(lián)合協(xié)同作用，選定在單因素試驗中增殖效果較明顯的幾種增殖因素(葡萄糖、胰蛋白胨和番茄汁)進行L9(34)正交試驗，其他營養(yǎng)成分按照MRS配方進行配制，以優(yōu)化FM-LP-4菌株的最佳增殖培養(yǎng)基。由表4可知，3個因素對FM-LP-4菌株活菌增殖量的影響順序為B>C>A，即影響FM-LP-4菌株生長發(fā)育的最主要因素是胰蛋白胨，其次是番茄汁。確定最佳增殖培養(yǎng)基配方為A2B3C2，即30 g/L的葡萄糖、35 g/L的胰蛋白胨、60 g/L番茄汁。

表4 FM-LP-4菌株培養(yǎng)基成分優(yōu)化正交試驗結(jié)果

2.13 驗證試驗

按照確定的培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，以原始MRS培養(yǎng)基為對照，裝液量均為80%，以3%的接種量接種，在溫度為 34 ℃ 條件下培養(yǎng)24 h，重復(fù)3次。原始培養(yǎng)基的FM-LP-4的D600 nm平均值為2.15，優(yōu)化培養(yǎng)中FM-LP-4的D600 nm平均值為2.54，優(yōu)化后的菌體D600 nm提高18.14%。

3 結(jié)論

通過對FM-LP-4菌株的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基進行研究，為FM-LP-4菌株作為功能型高密度發(fā)酵劑的制備提供技術(shù)支持。結(jié)果表明，F(xiàn)M-LP-4菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果確定FM-LP-4菌株的最佳增殖培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度為 34 ℃、接種量為3%、初始pH值為6.8。FM-LP-4菌株培養(yǎng)基配方的優(yōu)化確定為30 g/L葡萄糖、35 g/L胰蛋白胨、60 g/L 番茄汁，其他成分與MRS培養(yǎng)基基本配方一致。在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)18 h，F(xiàn)M-LP-4菌體D600 nm提高18.14%。