響應面法優(yōu)化樹脂純化茶多酚工藝研究

曹雪文， 熊道陵， 李洋， 王露琦， 宗毅， 歐陽少波

（江西理工大學冶金與化學工程學院，江西 贛州341000）

茶多酚是一類由多酚類衍生物組成的混合物，具有2-苯基苯并吡喃的基本結(jié)構(gòu)，C環(huán)是含氧六元苯并雜環(huán)，即吡喃環(huán)，其成分復雜，分子量不定，存在多種異構(gòu)體，多羥基的結(jié)構(gòu)使其顯酸性且具有較好的水溶性，苯環(huán)結(jié)構(gòu)使其具有獨特的光譜特性，基本結(jié)構(gòu)如圖1所示[1-2].在降血脂[3]、抗氧化[4]、消炎殺菌[5]、防癌防輻射[6]等方面都有顯著功效，此外，茶多酚在食品、飲品、冷藏等方面研究前景廣闊[7-8].

圖1 茶多酚基本結(jié)構(gòu)

目前茶多酚的提取工藝主要是水提與醇提.最近有研究者利用雙水相，再借助各類輔助手段進行改進來提取茶多酚.例如李洋等[9]利用該法使茶多酚提取率達到17.43%，但是制得的茶多酚粗品效果差強人意.為了得到純度更好的目標產(chǎn)物，未來研究的重點應放在純化工藝上.賴榕輝等[10]分別用硅膠與C18作為吸附劑，用甲醇、氯仿、水分梯度對其進行洗脫，來純化兒茶素單體.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硅膠純化的EGCG純度明顯高于C18純化的EGCG純度.該方法不僅工藝簡單，而且溶劑無毒無害，但是吸附劑的選擇工作投入較大.楊洋等[11]借助制備型高效液相色譜法將?；悄懰徕c成功從牛膽汁中分離純化，純度可達到98.1%，該方法純化目標產(chǎn)物的效果較好，但是應用范圍小，投入巨大.侯善欣等[12]嘗試了用高速逆流色譜法對茶多酚中的黃酮類物質(zhì)的分離，調(diào)節(jié)混合溶劑的配比，驗證了在流速5mL/min、轉(zhuǎn)速500 r/min下，該方法均可得到純度在99%的黃酮類物質(zhì)單體.該方法應用范圍有所擴大，但是操作量極少，不適合大規(guī)模生產(chǎn).

本研究本著綠色、環(huán)保、高效、的目的，對茶葉浸取液進行純化處理.依據(jù)茶多酚含有豐富酚羥基且自身可以形成氫鍵的特性，豐富的孤對電子與空軌道使其形成的氫鍵作用力較強的特性，利用大孔吸附樹脂的選擇性吸附的特點，借助Design-Expert軟件優(yōu)化工藝條件，本實驗建立了一種經(jīng)濟、環(huán)保、可重復生產(chǎn)的新工藝.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

采用的材料分別為：茶多酚標品，上海撫生實業(yè)有限公司生產(chǎn)；乙腈、乙酸（色譜純），隴西化工股份 有 限 公 司 生 產(chǎn) ；XDL-1、XDL-2、D-101、HPD-600、NKA-2、DM-301、HPD-722、NKA-9 型大孔吸附樹脂，滄州寶恩吸附材料科技有限公司生產(chǎn).

采用的儀器分別為：Pump System型高效液相色譜儀，德國賽卡姆公司生產(chǎn)；UV-6300型紫外可見分光光度計，上海美普達儀器有限公司生產(chǎn).

1.2 純化方法

準確稱取活化好的各個型號樹脂5.0000 g，加入一定量的提取液（稱取10.0000 g茶葉，用95℃水進行水浴加熱，浸提兩次，并將每次抽濾所得溶液合并為一份溶液），調(diào)節(jié)反應溫度與體系pH，按公式（1）、（2）、（3）分別求得樹脂的吸附量、吸附率和洗脫率.

其中，C0吸附前樣液的濃度 （mg/mL）；C1吸附后樣液的濃度（mg/mL）；C2洗脫液的濃度（mg/mL）；V 樣液體積（mL）；m 樹脂重量（g）.

實驗流程如圖2所示.

圖2 茶多酚純化工藝流程

1.3 分析方法

茶多酚溶液含量按照酒石酸亞鐵法[13]（GB/8313—2002）測定.

茶多酚產(chǎn)品液相色譜分析：分別配置0.4mg/mL的標液與樣液，分別過超濾膜，色譜柱：Agilent E clipse XDB-C18 （4.6mm×250mm，10 μL）； 流動相A：0.5%乙酸混合3%乙腈水溶液；流動相B：0.5%乙酸混合30%乙腈水溶液；檢測波長：280 nm；柱溫：30℃；流速：1mL/min，以標品與產(chǎn)品作對照，分析產(chǎn)品成分及含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂篩選試驗

在試驗初，測得樣液茶多酚濃度為3.15mg/mL，經(jīng)過對不同類型的樹脂的吸附-洗脫試驗，依次算得各個樹脂對茶多酚的吸附與洗脫的各項性能指標，如表1所示.

表1 不同大孔樹脂吸附-洗脫茶多酚能力比較

由表1可知，對茶多酚吸附能力最強的3種樹脂分別為：XDL-1、XDL-2、HPD-600， 而解析率最高的 3 種樹脂分別為：DM-301、XDL-1、D-101.通過比較發(fā)現(xiàn)，雖然DM-301的解析率比XDL-1略大，但是其吸附量相較于XDL-1差了13.28 mg/g.綜合考慮以上數(shù)據(jù)，選取XDL-1作為試驗所用樹脂對茶葉提取液中的茶多酚的純化.

2.2 靜態(tài)吸附試驗

2.2.1 吸附時間的影響

在吸附溫度為25℃、pH為6的條件下，在不同時間梯度下取測樹脂的吸附量，結(jié)果如圖3所示.

圖3 吸附量受時間的影響

由圖3可知，吸附量隨著時間的延長而升高，最后趨于水平狀態(tài).這是因為吸附開始階段，溶液中的目標產(chǎn)物含量相對較高，并且其與樹脂的接觸較充分.吸附量隨時間的延長而快速上升，但是當樹脂內(nèi)的吸附空間被填滿后，吸附量很難再提高.由實驗結(jié)果，本試驗選擇6 h為最佳吸附時間.

2.2.2 吸附溫度的影響

在吸附時間為6 h、pH為6的條件下，在不同溫度梯度下取測樹脂的吸附量，結(jié)果如圖4所示.

圖4 吸附量受溫度的影響

由圖4可知，吸附率隨溫度的升高而快速升高，當溫度達到25℃時，吸附率出現(xiàn)最高值，隨后呈緩慢下降趨勢.這是因為溫度升高體系中的分子運動加劇，促進了目標產(chǎn)物的分子快速擴散到樹脂內(nèi)部，但是溫度持續(xù)升高，樹脂內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生細微變化，在一定程度上阻礙了目標產(chǎn)物的進入，因此本試驗選擇25℃為最佳吸附溫度.

2.2.3 吸附pH的影響

在吸附時間為6 h、溫度為25℃的條件下，在不同pH梯度下取測樹脂的吸附量，結(jié)果如圖5所示.

圖5 吸附量受pH的影響

由圖5可知，體系pH在6之前，吸附率與pH呈正比例關(guān)系；pH在6時，吸附率達到了81.26%；當體系偏堿性后，吸附率迅速下降.這是因為目標產(chǎn)物中的酚羥基結(jié)構(gòu)有活潑的氫離子電離出，使得體系呈酸性條件時更有利于吸附的進行，當體系中出現(xiàn)OH-后，電離出的H+與之反應從而影響試驗結(jié)果.因此本試驗選取6作為最佳pH值.

2.3 靜態(tài)洗脫試驗

2.3.1 洗脫劑濃度的影響

在溫度為40℃、pH為6的條件下，用不同體積分數(shù)的洗脫劑洗脫2 h，分別取測洗脫率，結(jié)果如圖6所示.

圖6 洗脫率受洗脫劑體積分數(shù)的影響

由圖6可知，洗脫劑體積分數(shù)的升高有助于洗脫反應的進行，但是并不是體積分數(shù)越高越好.當體積分數(shù)到達80%時，洗脫率達到78%，出現(xiàn)最高值.但是之后響應值又有下降趨勢，這主要是因為洗脫劑體積分數(shù)的提高雖然能促進目標產(chǎn)物從樹脂中溶出，但是體積分數(shù)過高，導致洗脫劑流動性相對較差，又不利于目標產(chǎn)物的溶出.故而選取80%的乙醇作為本試驗的洗脫劑.

2.3.2 脫溫度的影響

用體積分數(shù)為80%的洗脫劑在pH為6的條件下，設(shè)置不同溫度洗脫2 h，分別取測洗脫率，結(jié)果如圖7所示.

圖7 洗脫率受洗脫劑溫度的影響

由圖7可知，洗脫溫度對洗脫率的影響比較顯著.在40℃之前，洗脫率隨著溫度的升高而升高，但是一旦溫度超過40℃，洗脫率反而下降.這主要是因為當溫度較低時，體系內(nèi)的分子整體活躍度不高，影響了洗脫反應的進行，而當溫度過高時，樹脂內(nèi)部結(jié)構(gòu)又出現(xiàn)膨脹現(xiàn)象，不利于目標產(chǎn)物的洗脫.故選取40℃為最佳洗脫溫度.

2.3.3 洗脫pH的影響

用體積分數(shù)為80%的洗脫劑在40℃的條件下，調(diào)節(jié)不同pH洗脫2 h，分別測洗脫率，結(jié)果如圖8所示.

圖8 洗脫率受洗脫劑pH的影響

由圖8可知，隨著洗脫劑pH的持續(xù)升高，洗脫率先升高隨后降低，在pH=6處出現(xiàn)最高值.鑒于茶多酚在偏酸性環(huán)境下較為穩(wěn)定，因此當體系偏堿性時洗脫率急劇下降，因此本試驗選取pH為6的乙醇溶液作為洗脫劑.

2.3.4 洗脫時間的影響

用體積分數(shù)為80%的洗脫劑在pH為6，溫度為40℃的條件下，分不同時間節(jié)點分別取測洗脫率，結(jié)果如圖9所示.

圖9 洗脫率受洗脫劑時間的影響

由圖9可知，隨著時間的推移，在脫附劑的作用下茶多酚從樹脂上洗脫得越多，但是過長的洗脫時間，會很大程度地影響試驗整體的進度，時間太短，又達不到洗脫的效果，當實驗進行到兩小時時，大部分茶多酚被洗脫下，而之后洗脫率增長速度較慢，因此洗脫時間確定在2 h為宜.

2.4 響應面法優(yōu)化洗脫工藝條件

2.4.1 Box-Behnken因素水平和編碼

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理[14]，以洗脫劑體積分數(shù)（A）、洗脫溫度（B）、洗脫 pH（C）、洗脫時間（D）為自變量，響應值（Y）為茶多酚的洗脫率，其因素水平和編碼詳見表2.

表2 Box-Behnken因素水平和編碼

2.4.2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

利用Design-Expert軟件在3水平4因素的基礎(chǔ)上共得到29組分析試驗，其試驗設(shè)計與結(jié)果詳見表3.

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

續(xù)表3 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

2.4.3 Box-Behnken試驗方差分析

利用Design-Expert軟件分析整理上述29組試驗結(jié)果，其結(jié)果詳見表4.

響應面中的系數(shù)R2與方差分析是直接判斷模型的可靠性的依據(jù)[15]，由表4數(shù)據(jù)分析可知，在模型中P值遠低于0.01，說明該模型的顯著性極強，試 驗 R2為 0.9613， 變 異 系 數(shù) （coefficient of variation，CV）為 0.59%，信噪比為 16.7183，即回歸方程的擬合度與可信度均達到了設(shè)計要求，故該模型可用于實驗工藝條件的優(yōu)化與預測[16].同時F值[17]的大小直接反映了各個因素與實驗結(jié)果關(guān)系的緊密程度即：洗脫時間（D）=126.99＞洗脫劑體積分數(shù)（A）=23.06＞洗脫溫度（B）=5.92＞洗脫 pH（C）=2.56，經(jīng)對試驗數(shù)據(jù)回歸擬合后可建立二次多元方程：

吸附率Y=79.20+0.63A+0.32B+0.21C+1.47D-0.40AB-0.10AC-0.27AD+0.17BC-0.075 BD+0.050CD-1.96A2-1.20B2-1.46C2-1.10D2

2.4.4 響應分析與提取工藝優(yōu)化

利用響應面法作圖可得洗脫率受洗脫體積、洗脫溫度、洗脫時間、洗脫pH四個單因素交互作用的影響，圖10、圖11只呈現(xiàn)了脫率Y受洗脫體積、洗脫溫度、洗脫時間三個單因素變量交互作用的影響.

圖10和圖11中的三維空間曲面圖與等高線分析圖直觀的反映了茶多酚洗脫率Y受洗脫體積、洗脫溫度、洗脫時間三個單因素變量交互作用的影響，兩圖曲面陡峭、等高線趨于橢圓，交互作用顯著（洗脫pH和這三個單因素變量的也有一定的交互影響，但是交互作用不顯著，故在此不做特別說明）通過對擬合方程的求解可預測四因素最佳工藝條件組合為：洗脫劑體積分數(shù)77.78%、洗脫溫度40.01℃、洗脫pH為6.18、洗脫時間2.43 h.為方便實際操作，將預測四因素最佳工藝條件修正為：洗脫劑體積分數(shù)80%、洗脫溫度40℃、洗脫pH為6、洗脫時間2.4 h.最終經(jīng)過3次重復試驗取平均值得洗脫率為79.20%，其預測值79.42%，說明該模型可以優(yōu)化該實驗的工藝條件.

表4 Box-Behnken試驗方差分析

圖10 洗脫劑體積分數(shù)與溫度對結(jié)果影響的等高線及響應面圖

圖11 洗脫劑體積分數(shù)與時間對結(jié)果影響的等高線及響應面圖

2.5 產(chǎn)品表征

通過不同時間所出的峰來確定被測物質(zhì)的性質(zhì)，而峰面積則可表示各物質(zhì)的含量，以此來表征茶多酚并達到測定其純度的目的.

在圖12、圖13中，各個峰形對應的物質(zhì)及相應面積如表5所示[18-19].

圖12 茶多酚標品液相譜圖

圖13 茶多酚產(chǎn)品液相譜圖

表5 茶多酚標品與產(chǎn)品出峰時間與面積對照

由圖12可知，不同的峰位置對應的時間分別為 ：3.795 min、4.439 min、4.962 min、5.158 min、8.856 min，在此檢測條件下的出峰時間分別對應的物質(zhì)為3.795min處對應的是Caf、4.439min處對應的是EGC、4.962min處對應的是EC、5.158min處對應的是EGCG、8.856min處對應的是ECG.由圖13可知，樣品的主要出峰時間與標品的出峰時間基本吻合，分別為：3.825min、4.503min、4.981min、3.209min、8.492min，即可斷定產(chǎn)品與標品屬于同一類物質(zhì)[20]，經(jīng)過樹脂吸附純化的目標產(chǎn)物純度可達到67.09wt%.與楊思勇等[21]研究結(jié)果相比，產(chǎn)物純度提高率達到48.17%.

3 結(jié) 論

1）本試驗通過對8種樹脂的選型試驗，選取XDL-1為試驗所用樹脂.

2）吸附試驗中，在吸附時間為6 h，溫度為25℃，pH為6的條件下，茶多酚的吸附率可達到83.21%.

3）在洗脫單因素試驗的基礎(chǔ)上，借助Design-Expert軟件進行單因素條件優(yōu)化，得出最佳條件為：洗脫劑濃度為80%，洗脫溫度為40℃，pH為8，洗脫時間為2 h，此時茶多酚的洗脫率為79.20%，其預測值79.42%，實際值與預測值相差不大，說明該模型可以優(yōu)化該實驗的工藝條件，茶多酚產(chǎn)品的純度可達到67.09 wt%.