黃 程，雷艷萍，李曉媚，楊文豪，熊 燕

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州蛇毒研究所，廣東 廣州 511436)

糖尿病是嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病，糖尿病患者易并發(fā)性功能障礙，在男性表現(xiàn)為陰莖勃起功能障礙(erectile dysfunction, ED)，俗稱陽痿，嚴(yán)重影響人們的身心健康和生活質(zhì)量[1]。但有關(guān)糖尿病ED的機(jī)制并不清楚，臨床也缺乏有效的防治藥物，因此，闡明糖尿病ED發(fā)病機(jī)制，并研發(fā)有效的防治藥物是醫(yī)學(xué)和藥學(xué)亟待解決的科學(xué)問題。

陰莖勃起是由神經(jīng)調(diào)節(jié)的血管活動，依賴于海綿體神經(jīng)和內(nèi)皮細(xì)胞合成、釋放一氧化氮(nitric oxide, NO)，通過活化海綿體平滑肌細(xì)胞鳥苷酸環(huán)化酶，使cGMP增加，促使陰莖海綿體平滑肌舒張，使陰莖充血勃起。當(dāng)性興奮結(jié)束后，海綿體平滑肌細(xì)胞磷酸二酯酶5(phosphodiesterase 5, PDE5)活化，降解cGMP，使勃起終止。大量研究表明，NO-cGMP通路紊亂是導(dǎo)致ED的主要因素[2]。NO是由L-精氨酸在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)催化下轉(zhuǎn)化而來。L-精氨酸同系物非對稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine, ADMA)為NOS內(nèi)源性抑制物，可抑制NOS并使之解偶聯(lián)，一方面減少NO合成，另一方面增加超氧陰離子生成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激[3]。體內(nèi)ADMA主要是由蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(protein arginine methyltransferase 1, PRMT1)催化含精氨酸殘基的蛋白質(zhì)甲基化，再經(jīng)蛋白水解作用釋放而來，并主要由二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase, DDAH)代謝降解，因此，PRMT1-ADMA-DDAH是體內(nèi)調(diào)節(jié)NO生成的重要信號通路。

近年研究發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠海綿體對罌粟堿的舒張反應(yīng)降低，并伴有海綿體內(nèi)源性ADMA蓄積，NO與cGMP含量減少[4]。香煙尼古丁致ED兔海綿體ADMA含量也明顯增加，并伴有DDAH活性降低[5]。2型糖尿病ED患者陰莖海綿體內(nèi)皮型NOS(eNOS)和神經(jīng)型NOS(nNOS)解偶聯(lián)，氧化應(yīng)激增加[3]。Meta分析顯示，eNOS基因單核苷酸多態(tài)性與ED呈強(qiáng)相關(guān)[2]。這些研究提示，內(nèi)源性ADMA蓄積導(dǎo)致NOS活性抑制和NO合成減少，不僅與吸煙所致ED和老齡ED密切相關(guān)，也可能參與糖尿病ED的病理生理過程。

臨床上，PDE5抑制劑西地那非等被廣泛用作各種ED治療的首選藥。越來越多的文獻(xiàn)報道，西地那非可明顯改善ED患者和動物勃起功能[6]，但糖尿病ED患者對西地那非的療效明顯低于非糖尿病ED患者[7]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，西地那非并不能改善糖尿病大鼠海綿體eNOS、nNOS、PDE5基因和蛋白表達(dá)[8]。對以上不同的研究結(jié)果，巴西學(xué)者分別評估了糖尿病ED和非糖尿病ED患者對西地那非的反應(yīng)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血中亞硝酸鹽水平與糖尿病ED患者對西地那非的反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)，提示體內(nèi)NO水平與ED患者對西地那非的療效有關(guān)[9]。由此推測，糖尿病ED患者對西地那非療效差的主要原因是由于海綿體NO減少，而不是PDE5過度活化所致。因此，闡明糖尿病ED海綿體NO缺乏的原因，研發(fā)促NO合成的藥物，對糖尿病ED防治具有重要意義。

L-精氨酸作為NO合成前體，在ED形成及防治研究中也倍受關(guān)注。最近研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重ED和動脈性ED患者血清L-精氨酸水平明顯低于輕度ED和非動脈性ED患者[10]。體外L-精氨酸孵育可改善老齡大鼠海綿體對乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)或電刺激的舒張反應(yīng)[11]?？诜﨤-精氨酸可改善男性不育患者的精子質(zhì)量和勃起功能[12]。但對于L-精氨酸能否改善糖尿病ED及其機(jī)制，尚未見國內(nèi)外文獻(xiàn)報道。因此，本研究擬在2型糖尿病大鼠中，探討內(nèi)源性ADMA在糖尿病ED形成中的重要作用，并觀察L-精氨酸對糖尿病大鼠ED的治療效果，同時在體外比較L-精氨酸與西地那非對糖尿病大鼠海綿體舒張功能障礙的改善作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑苯腎上腺素(phenylephrin, PE)、ACh、ADMA、L-精氨酸、西地那非(sildenafil, SIL)、鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)、二乙酰單肟、安替比林，均購自美國Sigma公司；抗PRMT1、DDAH1、DDAH2抗體，購自Abcam公司；抗PDE5、 NOS1-3、β-actin抗體，購自美國Santa Cruz公司；NO含量、NOS活性、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、RIPA裂解液、ECL發(fā)光試劑盒，均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；組織ADMA和cGMP ELISA檢測試劑盒，購自上海研吉公司；其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2動物模型的制備及分組SPF級健康♂Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量180～200 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SYXK(粵)2010-0104。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對照組、糖尿病組、糖尿病+L-精氨酸治療組、L-精氨酸對照組，每組5只。2型糖尿病大鼠模型制備采用高脂飼養(yǎng)+小劑量STZ(30 mg·kg-1, i.p.)注射方法制備[13]，并連續(xù)3 d檢測尿糖為～者，再行連續(xù)2次隔日檢測隨機(jī)血糖≥16 mmol·L-1，則認(rèn)為糖尿病大鼠模型成立，繼續(xù)高脂飼養(yǎng)8周。正常對照組和L-精氨酸對照組用基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)4周后，一次性腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液(pH 4.2)，再繼續(xù)用基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)8周。

1.3方法

1.3.1 口服糖耐量的測定 糖尿病大鼠造模8周后，測定口服糖耐量以評價胰島素敏感性。先將大鼠禁食12 h后，經(jīng)尾靜脈采血測定空腹血糖值(blood glucose，BG)，然后一次性灌胃給予40%葡萄糖溶液(2 g·kg-1)，分別在灌胃后30、60、90、120 min檢測血糖值，繪制血糖-時間曲線，并采用梯形法計算曲線下面積[13]。

1.3.2 海綿體舒張功能測定 水合氯醛(300 mg·kg-1，i.p.)麻醉，頸動脈插管收集血標(biāo)本后，快速摘取陰莖，按我室已建立的方法，檢測大鼠離體海綿體對ACh的舒張反應(yīng)，以反映陰莖勃起功能[13]。并記錄各濃度點海綿體張力變化，并計算舒張百分率。在體外藥物治療實驗中，記錄第1次海綿體對ACh的舒張反應(yīng)后，分別用L-精氨酸(3 mmol·L-1)和西地那非(3 μmol·L-1)孵育45 min，再檢測海綿體對ACh的舒張百分率；并將藥物孵育前后兩次最大舒張百分率的比值，用以評價L-精氨酸和西地那非對糖尿病大鼠海綿體舒張功能障礙的體外治療作用。

1.3.3 生化測定

1.3.3.1 血清和組織ADMA水平測定 采用高效液相色譜法測定大鼠血清ADMA濃度[13]，通過比較樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積比值，以及標(biāo)準(zhǔn)品ADMA濃度，計算樣品ADMA的濃度；采用大鼠ELISA試劑盒檢測海綿體組織ADMA含量。

1.3.3.2 DDAH、NOS活性及NO含量測定 按我室已建立的方法測定海綿體組織DDAH活性。制備5%海綿體組織勻漿，取其上清50 μL與1 mmol·L-1ADMA反應(yīng)，加入二乙酰單肟和安替比林共孵育100 min，用Epoch全波長酶標(biāo)儀(美國BoiTek公司)在466 nm波長處讀取吸光度值(A466)。計算L-胍氨酸生成量，以反映DDAH活性，其活性單位定義為每分鐘催化生成1 μmol·L-1的L-胍氨酸所需要的DDAH量(U·g-1Pro)。分別用NOS和NO試劑盒，檢測海綿體NOS活性及NO穩(wěn)定代謝產(chǎn)物硝酸鹽/亞硝酸鹽含量，反映NO生成[13]。

1.3.3.3 氧化應(yīng)激、cGMP和蛋白含量測定 用黃嘌呤氧化酶法測定海綿體SOD活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，反映氧化應(yīng)激[13]。采用大鼠cGMP ELISA試劑盒檢測海綿體組織cGMP含量。采用雙縮脲法測定組織蛋白含量，用以標(biāo)化上述生化指標(biāo)[14]。

1.3.4 蛋白表達(dá)檢測 制備10%大鼠海綿體組織的RIPA裂解液，用Western blot法檢測PRMT1、DDAH1、DDAH2、eNOS、nNOS、iNOS、PDE5等蛋白表達(dá)[13-14]。每孔上樣30 μg蛋白，經(jīng)電泳分離后，電轉(zhuǎn)至PDVF膜上，室溫封閉1 h后，加一抗(PRMT1、DDAH1、DDAH2 的濃度為1 ∶1 000，eNOS、nNOS、iNOS、PDE5的濃度為1 ∶500)4 ℃孵育過夜，再加二抗室溫孵育2 h，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDocTMXRS+System，Bio-Rad公司)掃描，用Image Pro軟件進(jìn)行圖像分析。

2 結(jié)果

2.1L-精氨酸體內(nèi)治療改善糖尿病大鼠的口服糖耐量如Fig 1所示，糖尿病大鼠空腹血糖明顯高于正常對照組(P<0.01)，葡萄糖負(fù)荷(2 g·kg-1, i.g.)后，糖尿病大鼠各時間點的血糖水平及血糖-時間曲線下面積均明顯高于正常對照組(P<0.01)，表明糖尿病大鼠糖耐量降低。經(jīng)L-精氨酸(100 mg·kg-1·d-1, i.g.)體內(nèi)治療8周后，既可降低糖尿病大鼠的空腹血糖水平，也可降低糖負(fù)荷后2 h的血糖濃度(P<0.05)，但不影響正常大鼠的空腹血糖和糖負(fù)荷后血糖水平，提示L-精氨酸治療8周可改善糖尿病大鼠的糖耐量降低。

2.2L-精氨酸治療改善糖尿病大鼠海綿體的舒張功能如Fig 2所示，與正常對照組比較，糖尿病大鼠海綿體對ACh誘導(dǎo)的最大舒張反應(yīng)明顯降低(P<0.01)，提示糖尿病大鼠ED；L-精氨酸體內(nèi)治療明顯增加糖尿病大鼠離體海綿體對ACh的最大舒張反應(yīng)(P<0.05)，但對正常對照組大鼠離體海綿體的最大舒張反應(yīng)無明顯影響。將糖尿病大鼠離體海綿體在體外用L-精氨酸(3 mmol·L-1)孵育45 min，也能增加其對ACh的最大舒張反應(yīng)(P<0.05)；然而，用PDE5抑制劑西地那非(3 μmol·L-1)體外孵育糖尿病大鼠離體海綿體，則不影響其對ACh的最大舒張反應(yīng)。提示L-精氨酸無論是體內(nèi)還是體外治療，均能明顯改善糖尿病大鼠海綿體的舒張功能損害。

2.3L-精氨酸對海綿體ADMA、NO、cGMP含量以及DDAH、NOS活性的影響如Tab 1所示，糖尿病大鼠血清中ADMA濃度明顯高于正常對照組(P<0.01)，海綿體內(nèi)源性ADMA蓄積增加(P<0.05)，DDAH及NOS活性降低(P<0.05)，NO和cGMP含量均減少(P<0.01)，提示糖尿病大鼠海綿體組織DDAH/ADMA/NOS/NO/cGMP通路紊亂。給予L-精氨酸體內(nèi)治療8周后，糖尿病大鼠血清ADMA濃度明顯降低(P<0.01)，海綿體內(nèi)源性ADMA蓄積減少(P<0.05)，DDAH及NOS活性增強(qiáng)(P<0.05)，NO和cGMP含量增加(P<0.01)，提示L-精氨酸治療可逆轉(zhuǎn)糖尿病大鼠海綿體DDAH/ADMA/NOS/NO/cGMP通路紊亂，但對正常大鼠海綿體DDAH/ADMA/NOS/NO/cGMP通路無明顯影響。

2.4L-精氨酸對海綿體PRMT1/DDAH/NOS/PDE5通路蛋白表達(dá)影響如Fig 3所示，與正常對照組比較，糖尿病組大鼠海綿體PRMT1蛋白表達(dá)上調(diào)，而DDAH1和DDAH2蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，eNOS和nNOS的蛋白表達(dá)降低，而iNOS蛋白表達(dá)增加(P<0.01)，此外，PDE5蛋白表達(dá)也上調(diào)(P<0.01)。

Fig 1 Treatment with L-arginine for 8 weeks improved the impairment of oral glucose tolerance in diabetic

A: Plasma glucose concentration-time curve; B: AUC of plasma glucose.**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsDM.

Tab 1 L-arginine treatment in vivo reversed disorder of DDAH/ADMA/NOS/NO/cGMP pathway

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsDM

A: Effect of L-arginine treatmentinvivo; B: Effect of L-arginine treatmentinvitro; C: Effect of sildenafil treatmentinvitro.**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsDM.

提示糖尿病大鼠海綿體組織PRMT1/DDAH/NOS/PDE5通路蛋白表達(dá)紊亂。經(jīng)L-精氨酸體內(nèi)治療8周后，基本可逆轉(zhuǎn)以上異常(P<0.05，P<0.01)，但對正常大鼠海綿體PRMT1/DDAH/NOS/PDE5通路蛋白表達(dá)無明顯影響。提示L-精氨酸體內(nèi)治療可改善PRMT1/DDAH/NOS/PDE5通路蛋白表達(dá)的異常。

2.5L-精氨酸降低糖尿病大鼠海綿體氧化應(yīng)激如Fig 4所示，與正常對照組比較，糖尿病大鼠海綿體抗氧化酶SOD活性降低(P<0.01)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示糖尿病大鼠海綿體氧化應(yīng)激增加。用L-精氨酸體內(nèi)治療8周后，不僅能提高糖尿病大鼠海綿體SOD活性，還能降低MDA含量(P<0.01，P<0.05)，提示L-精氨酸體內(nèi)治療可降低糖尿病大鼠海綿體氧化應(yīng)激。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠海綿體舒張功能明顯降低，并伴有內(nèi)源性ADMA蓄積和海綿體PRMT1/ADMA/DDAH/NOS/PDE5通路紊亂；經(jīng)L-精氨酸灌胃治療8周，不僅改善糖尿病大鼠海綿體舒張功能障礙，還降低內(nèi)源性ADMA蓄積，并糾正海綿體PRMT1/ADMA/DDAH/NOS/PDE5通路紊亂。為闡明糖尿病ED的發(fā)病機(jī)制及其治療提供了新的實驗數(shù)據(jù)。

Fig 3 L-arginine treatment in vivo normalized abnormal protein expression of PRMT1/DDAH/NOS

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDM

Fig 4 L-arginine treatment in vivo suppressed oxidative stress in corpus cavernosum of diabetic

A:SOD activity; B: MDA content.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsDM.

評價人類ED的嚴(yán)重性主要采用5項國際勃起功能指數(shù)(the International Index of Erectile Function, IIEF-5)評分[1, 6-7, 9-10]。評價動物ED，體內(nèi)實驗常采用陰莖海綿體內(nèi)壓(intracavernous pressure, ICP)及其與平均動脈壓(mean arterial pressure, MAP)的比值來反映[4,8]，體外實驗常采用電刺激或藥物如ACh等誘導(dǎo)離體海綿體的舒張反應(yīng)來反映[5,15]。本研究通過檢測離體海綿體對ACh的最大舒張反應(yīng)來評估糖尿病大鼠勃起功能，證明了糖尿病大鼠ED與陰莖海綿體NO/cGMP信號損害有關(guān)。相似的實驗結(jié)果也在老齡ED大鼠[4]、注射香煙抽提物致ED兔[5]和動脈粥樣硬化ED大鼠等動物模型觀察到。來自陰莖假體移植患者的離體海綿體研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病ED患者海綿體內(nèi)皮依賴性舒張功能和電刺激的舒張反應(yīng)損害均比非糖尿病ED患者嚴(yán)重，海綿體cGMP含量也更低，并且對PDE5抑制劑誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)不明顯[15]。臨床分析發(fā)現(xiàn)，糖尿病ED患者血漿亞硝酸鹽水平與其對PDE5抑制劑的治療效果呈負(fù)相關(guān)[9]。這些研究結(jié)果均直接或間接支持我們關(guān)于糖尿病ED是由于海綿體NO/cGMP信號損害所致的實驗結(jié)論。然而，導(dǎo)致糖尿病患者和動物海綿體NO/cGMP降低或損害的機(jī)制不完全清楚，深入研究對糖尿病ED的防治具有重要意義。

最近研究發(fā)現(xiàn)，海綿體內(nèi)源性ADMA蓄積與衰老大鼠ED和香煙尼古丁所致兔ED有關(guān)[4-5]。因此，本研究檢測糖尿病ED大鼠血清和海綿體ADMA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病ED大鼠不僅血清ADMA濃度明顯升高，海綿體內(nèi)源性ADMA也明顯蓄積，還伴有海綿體NOS活性抑制，eNOS和nNOS表達(dá)降低。依據(jù)這些結(jié)果，我們提出“海綿體內(nèi)源性ADMA蓄積及其所致的NOS活性抑制、eNOS和nNOS表達(dá)下調(diào)，是導(dǎo)致糖尿病ED海綿體NO/cGMP信號降低的重要原因”的觀點。已知ADMA抑制NOS，可使其解偶聯(lián)，不僅減少NO生成，還增加氧自由基產(chǎn)生[3]，因此，本研究檢測了海綿體SOD活性及MDA含量以反映氧化應(yīng)激。結(jié)果證明，糖尿病ED大鼠海綿體氧化應(yīng)激的確增加。雖然已知DDAH和PRMT1與內(nèi)源性ADMA生成與代謝有關(guān)，本研究揭示了糖尿病ED大鼠海綿體ADMA蓄積不僅是由于DDAH活性及表達(dá)降低所致，也與PRMT1表達(dá)增加有關(guān)。海綿體ADMA蓄積與DDAH和NOS活性降低的相似結(jié)果，也在老齡ED大鼠[4]、注射香煙抽提物所致ED兔[5]和動脈粥樣硬化ED大鼠觀察到，這些結(jié)果均間接支持了我們的觀點。

為了進(jìn)一步驗證我們的觀點，并尋找治療糖尿病ED的更好藥物，本研究觀察了NO合成前體L-精氨酸體內(nèi)治療8周對糖尿病大鼠ED的療效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L-精氨酸體內(nèi)治療不僅能降低糖尿病大鼠內(nèi)源性ADMA蓄積，還明顯改善糖尿病ED，并可糾正糖尿病大鼠海綿體PRMT1/DDAH/ADMA/NOS/PDE5信號通路紊亂和氧化應(yīng)激。不僅如此，L-精氨酸體外孵育糖尿病大鼠海綿體也能明顯改善其舒張功能障礙，而用PDE5抑制劑西地那非體外孵育則不能。這些結(jié)果進(jìn)一步證明，內(nèi)源性ADMA蓄積導(dǎo)致NO缺乏是糖尿病大鼠ED的主要原因，而不是PDE5過度活化所致?；A(chǔ)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病ED病人和動物對PDE5抑制劑治療效果不佳[7-8]，有研究推測這可能與糖尿病時血中NO水平降低，以及PDE5抑制劑不能改善海綿體NOS表達(dá)、活性與NO合成有關(guān)[8-9]。因為能增加NOS表達(dá)和保護(hù)NO不被滅活的白藜蘆醇和抗氧化劑等藥物，也能改善糖尿病病人和動物的ED，與PDE5抑制劑聯(lián)合治療可產(chǎn)生協(xié)同作用[8]。這些研究結(jié)果雖然來自各種ED病人和多種動物模型，都直接或間接地支持我們的實驗結(jié)果和觀點。

綜上所述，本研究揭示海綿體內(nèi)源性NOS抑制物ADMA蓄積是導(dǎo)致糖尿病大鼠ED的重要原因；NO合成前體L-精氨酸無論是體內(nèi)治療，還是體外孵育，對糖尿病大鼠離體海綿體舒張功能障礙均有明顯的改善，其機(jī)制與上調(diào)海綿體DDAH和NOS活性與表達(dá)，增加NO合成，降低氧化應(yīng)激有關(guān)。本研究為L-精氨酸用于臨床防治糖尿病ED提供了重要的實驗依據(jù)。