韓 莎 胡 煒 李成林 朱夕波 趙 斌 張少春 孫永軍

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pH脅迫對(duì)刺參存活、生長(zhǎng)及抗氧化酶活性的影響*

韓 莎1胡 煒1李成林1①朱夕波2趙 斌1張少春1孫永軍3

(1. 山東省海洋生物研究院 青島 266104；2. 日照市嵐山區(qū)漁業(yè)技術(shù)推廣站 日照 276800；3. 好當(dāng)家集團(tuán)有限公司 威海 264300)

本研究比較分析了在對(duì)照組(pH為8.4)、低pH脅迫組(pH為6.8、7.0、7.2、7.4、7.6和7.8)和高pH脅迫組(pH為8.6、8.8、9.0、9.2、9.4和9.6)的養(yǎng)殖水環(huán)境下，脅迫36 d對(duì)刺參(Selenka)存活、生長(zhǎng)及抗氧化酶活性的影響。結(jié)果顯示，不同pH對(duì)刺參存活、生長(zhǎng)及抗氧化酶活性有顯著影響。在pH 7.4~9.0范圍內(nèi)，刺參存活率為100%，隨著pH脅迫強(qiáng)度和脅迫時(shí)間的增加，刺參存活率逐漸降低，當(dāng)pH為6.8、7.0和9.6時(shí)，自第3天起，刺參處于過(guò)度應(yīng)激狀態(tài)，繼而有死亡個(gè)體出現(xiàn)，至30 d時(shí)刺參死亡率為100%。不同pH顯著影響刺參生長(zhǎng)，刺參特定生長(zhǎng)率隨pH脅迫程度增加呈下降趨勢(shì)，當(dāng)pH為9.0時(shí)，刺參出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)。各pH脅迫組刺參超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性均高于對(duì)照組，且隨pH脅迫程度的增加呈先升高后下降的變化趨勢(shì)。在低pH組中，以pH=7.4時(shí)刺參SOD和CAT活性最高，分別達(dá)到(74.92±2.24) U/ml和(14.99±2.38) U/ml，顯著高于對(duì)照組；而在高pH組中，SOD和CAT活性分別以pH 8.8和9.0時(shí)最高，分別達(dá)到(72.90±1.10) U/ml和(15.68±0.89) U/ml，顯著高于對(duì)照組。結(jié)果表明，pH在7.4~9.0范圍內(nèi)是刺參存活與生長(zhǎng)的適宜水環(huán)境，過(guò)高或過(guò)低均會(huì)引起刺參不同程度的應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致刺參的死亡。

刺參；pH；存活；生長(zhǎng)；抗氧化酶

刺參(Selenka)以極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值成為海水養(yǎng)殖單品種產(chǎn)值最高的品種，近年來(lái)，刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，養(yǎng)殖規(guī)模和空間拓展不斷擴(kuò)大。目前，我國(guó)刺參增養(yǎng)殖面積為20余萬(wàn)hm2，年產(chǎn)量約20.4萬(wàn)t，年產(chǎn)值超過(guò)350億元(李成林等, 2010、2017)。然而，在刺參產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展的同時(shí)，生產(chǎn)中也出現(xiàn)了一系列不同程度的瓶頸問(wèn)題，諸如養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境惡化、種質(zhì)資源退化、病害頻繁發(fā)生等，嚴(yán)重制約了刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展(常亞青等, 2006; 李成林等, 2010、2017)。其中，環(huán)境脅迫是人工養(yǎng)殖條件下導(dǎo)致刺參應(yīng)激或發(fā)病的主要因素之一。在環(huán)境因子脅迫下，刺參會(huì)產(chǎn)生不同程度的應(yīng)激反應(yīng)，過(guò)度的應(yīng)激反應(yīng)會(huì)使刺參出現(xiàn)異常的生理狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致其生長(zhǎng)緩慢、免疫力降低，大大增加感染疾病的幾率。目前，許多學(xué)者對(duì)刺參的環(huán)境脅迫適應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了研究，多集中在鹽度(胡煒等, 2012; 董曉亮等, 2013; 庚辰帆等, 2015; 趙斌等, 2015)、溫度(董云偉等, 2009)、低溶氧(李根瑞等, 2016)、氨氮(臧元奇等, 2012)、亞硝態(tài)氮(陳蕓燕等, 2013)等脅迫因子的研究上，而有關(guān)環(huán)境因子中pH對(duì)刺參生理生態(tài)影響的研究甚少。

酸堿度作為水環(huán)境生態(tài)平衡的關(guān)鍵指標(biāo)之一，是水中化學(xué)性狀和生命活動(dòng)的綜合反映(趙先銀等, 2011)，不僅直接影響水生生物的存活、生長(zhǎng)等生理機(jī)能，還會(huì)影響水體中氨態(tài)氮、硫化氫和重金屬離子等化學(xué)物質(zhì)的存在形式及含量，間接影響水生生物的生長(zhǎng)、存活與繁殖(曾媛媛等, 2008)。通常情況下，自然海水pH范圍為7.8~8.5，水質(zhì)條件的變化時(shí)常會(huì)導(dǎo)致水體pH在4~10范圍內(nèi)波動(dòng)變化(Zhao, 2010)。在刺參養(yǎng)殖池塘中，水體pH常因連續(xù)陰天、持續(xù)高溫、驟降暴雨、水質(zhì)污染、生物種群突變、底質(zhì)老化等因素的影響而發(fā)生變化，時(shí)常呈現(xiàn)周期性或臨時(shí)性的波動(dòng)。

迄今為止，有關(guān)pH對(duì)刺參生理生態(tài)影響的研究?jī)H限于對(duì)刺參苗期存活率、生長(zhǎng)指標(biāo)及免疫功能等的評(píng)價(jià)(Zhao, 2010; Yuan, 2010)，而對(duì)其在養(yǎng)殖期間生理指標(biāo)變化的研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以大規(guī)格刺參為研究對(duì)象，研究了不同pH對(duì)刺參存活、生長(zhǎng)及免疫功能的影響，旨在進(jìn)一步探明刺參對(duì)pH的適應(yīng)性，以及在pH脅迫下的刺參免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，以期為刺參健康養(yǎng)殖過(guò)程中水環(huán)境調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用刺參取自山東省海洋生物研究院種質(zhì)資源研究中心，選取表觀正常、伸展自如、健康活力強(qiáng)的刺參，平均體重為(7.02±0.81) g，置于容積為1.0 m3的圓形玻璃鋼水槽中暫養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)于2016年4月在本中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)沉淀、砂濾的自然海水，溫度為18.8~23.9℃，鹽度為31.3±0.6。實(shí)驗(yàn)期間，24 h充氣，日投喂人工配合飼料1次，投喂量為刺參體重的3%~5%，每天全量換水并清除殘餌和糞便，暫養(yǎng)適應(yīng)15 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)共設(shè)12個(gè)pH處理組，分別為6個(gè)低pH組(pH為6.8、7.0、7.2、7.4、7.6和7.8)和6個(gè)高pH組(pH為8.6、8.8、9.0、9.2、9.4和9.6)，并設(shè)對(duì)照組(pH=8.4)。各處理組和對(duì)照組實(shí)驗(yàn)刺參均為10頭，放養(yǎng)于80 cm′60 cm′48 cm的整理箱中，每處理組均設(shè)3個(gè)平行。各實(shí)驗(yàn)組使用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，每日定時(shí)采用哈納HI98185多參數(shù)水質(zhì)分析儀測(cè)定并及時(shí)校正水的pH值，變化幅度不超過(guò)±0.05個(gè)單位。pH調(diào)節(jié)采取逐步變化的方式，日全量換水1次，pH日變化幅度為0.2個(gè)單位，各實(shí)驗(yàn)組pH達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)pH時(shí)，開(kāi)始脅迫實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)期間，觀測(cè)刺參存活、攝食及活動(dòng)情況，發(fā)現(xiàn)死亡個(gè)體及時(shí)清除，每6 d統(tǒng)計(jì)各pH組刺參死亡數(shù)量，每12 d測(cè)定1次生長(zhǎng)情況，實(shí)驗(yàn)周期為36 d。

1.3 樣品采集與免疫酶指標(biāo)測(cè)定

在脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，從每個(gè)處理組中隨機(jī)選取刺參3~5頭，用5.0 ml一次性注射器抽取刺參體腔液，將其在4℃下以1000 r/min離心10 min，取上清液分裝于500ml滅菌離心管中，置于–80℃冰箱中待測(cè)。超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定均采用南京生物工程研究所研制的試劑盒測(cè)定。

1.4 存活和生長(zhǎng)指標(biāo)的計(jì)算

實(shí)驗(yàn)期間刺參累計(jì)死亡率采用以下公式計(jì)算：

累計(jì)死亡率(%)=t/0×100

式中，0為實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)刺參頭數(shù)，t為實(shí)驗(yàn)期間測(cè)定時(shí)刺參累計(jì)死亡頭數(shù)。

實(shí)驗(yàn)期間刺參特定生長(zhǎng)率(Specific growth rate, SGR)采用以下公式計(jì)算：

SGR (%/d)=(lnt–ln0)/×100

式中，0為初始體重(g)，t為終末體重(g)，為實(shí)驗(yàn)天數(shù)(d)。

通過(guò)測(cè)定攝食率(Feeding rate, FR)與食物轉(zhuǎn)化率(Food conversion efficiency, FCE)，觀測(cè)pH脅迫對(duì)刺參攝食的影響。計(jì)算公式如下：

FR(%)=2/[(W+0)]×100

FCE(%)=100×(W?0)/

式中，0為體重初始值(g)，W為測(cè)定值(g)，為實(shí)驗(yàn)時(shí)間(d)，為飼料總攝入量(g)?

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 16.0和Excel 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用單因素方差分析(One-way ANOVA)和多重比較分析不同pH組之間的差異。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)，<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 pH脅迫對(duì)刺參存活的影響

經(jīng)不同pH脅迫后，刺參的存活情況受到不同程度的影響，刺參累計(jì)死亡率如圖1所示。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在pH為7.4~9.0處理組中，刺參存活率最高，均為100%；存活率最低的為pH 6.8、7.0和9.6組，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)刺參存活率均為0；其余各pH處理組刺參存活率差異較大，隨著脅迫程度的加強(qiáng)，存活率顯著下降(<0.05)。

在低pH處理組中，pH 6.8和7.0組刺參脅迫至第3天時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)吐腸、化皮等應(yīng)激反應(yīng)，脅迫6 d后，刺參累計(jì)死亡率呈現(xiàn)顯著差異(<0.05)，死亡率均為6.67%，且隨著實(shí)驗(yàn)的持續(xù)進(jìn)行，2組的累計(jì)死亡率均大幅升高，至12 d時(shí)差異顯著(<0.05)，至第30天時(shí)實(shí)驗(yàn)刺參均全部死亡，而pH 7.2組刺參在脅迫12 d后出現(xiàn)死亡個(gè)體，隨后刺參死亡個(gè)體數(shù)逐日小幅增加，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)累計(jì)死亡率達(dá)到46.67%。

在高pH處理組中，pH9.6組脅迫至第5天時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)化皮現(xiàn)象，至6 d時(shí)累積死亡率達(dá)到6.67%，且隨著實(shí)驗(yàn)的持續(xù)進(jìn)行，累計(jì)死亡率大幅升高(<0.05)，至第30天時(shí)實(shí)驗(yàn)刺參均全部死亡；而pH 9.0和9.2組刺參在脅迫6 d后才出現(xiàn)死亡個(gè)體，之后累計(jì)死亡率小幅上升，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，pH 9.0和9.2組的累計(jì)死亡率分別為36.67%和50.00%。

圖1 pH脅迫對(duì)刺參累計(jì)死亡率的影響

2.2 pH脅迫對(duì)刺參生長(zhǎng)的影響

pH脅迫對(duì)刺參生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表1。由表1可以看出，至脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組刺參終末體重最高，平均體重達(dá)(8.95±2.06) g。隨著脅迫程度的加強(qiáng)，各pH處理組刺參終末體重均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，除pH 7.8組外，其他各實(shí)驗(yàn)組刺參平均體重均顯著低于對(duì)照組(<0.05)，尤其是pH 9.0組刺參出現(xiàn)體重負(fù)增長(zhǎng)，體重最低，為(6.44±1.86) g。

表1 pH脅迫對(duì)刺參生長(zhǎng)的影響

Tab.1 The growth of sea cucumber at different pH

注：不同字母表示組間差異顯著(<0.05)。下同

Note: The means with different letters within the same column are significantly different at the 0.05 probability level. The same as below

在低pH處理組中，當(dāng)pH為7.4~7.8時(shí)，至12 d時(shí)，刺參SGR1顯著高于對(duì)照組(<0.05)，而隨著實(shí)驗(yàn)的持續(xù)進(jìn)行，pH 7.4組刺參SGR2逐漸下降且低于對(duì)照組，當(dāng)脅迫時(shí)間超過(guò)24 d時(shí)，刺參SGR3均大幅降低，呈現(xiàn)為負(fù)值(<0.05)。

在高pH處理組中，當(dāng)pH為8.6~8.8時(shí)，至12 d時(shí)，刺參SGR1高于對(duì)照組，而pH 9.0組SGR1顯著低于對(duì)照組(<0.05)；而12 d之后，高pH組刺參SGR2均顯著低于對(duì)照組(<0.05)，尤其是在24 d后，SGR3均降為負(fù)值。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組SGR為(0.68± 0.19)%/d，其他脅迫組刺參SGR均顯著低于對(duì)照組，其中，pH 9.0組SGR最低，為(–0.26±0.34)%/d。高pH脅迫對(duì)刺參生長(zhǎng)的影響更為顯著。

2.3 pH脅迫對(duì)刺參攝食的影響

不同pH脅迫下刺參攝食率(FR)和刺參食物轉(zhuǎn)化率(FCE)見(jiàn)表2。從表2可以看出，刺參的攝食率以對(duì)照組攝食率最大，為(2.26±0.15)%。隨著pH脅迫程度的增加，刺參攝食率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。在低pH處理組中，低于pH 7.6的實(shí)驗(yàn)組刺參攝食率組內(nèi)差異顯著(<0.05)，實(shí)驗(yàn)刺參所排泄糞便呈細(xì)短狀；在高pH處理組中，高于pH 8.8的實(shí)驗(yàn)組刺參攝食率大幅下降，顯著低于對(duì)照組(<0.05)，實(shí)驗(yàn)刺參出現(xiàn)整個(gè)身體逐漸收縮至緊縮、體表棘刺短平、活力較弱、排泄糞便不成形等現(xiàn)象。

表2顯示，不同pH脅迫對(duì)刺參食物轉(zhuǎn)化率有顯著影響。pH=7.8時(shí)，實(shí)驗(yàn)組刺參的FCE達(dá)到最大值，為(24.86±1.15)%，但與對(duì)照組差異不顯著(>0.05)，其他各pH脅迫組刺參的FCE均顯著低于對(duì)照組(<0.05)。從表2明顯看出，與低pH脅迫相比，高pH脅迫對(duì)刺參食物轉(zhuǎn)化率的影響更為顯著。

表2 pH脅迫對(duì)刺參攝食率和食物轉(zhuǎn)化率的影響

Tab.2 The feeding rate and food conversion efficiency of sea cucumber at different pH

2.4 pH脅迫對(duì)刺參SOD活性的影響

不同pH對(duì)刺參體內(nèi)SOD活性的影響見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，隨著高、低pH脅迫程度的加強(qiáng)，刺參體內(nèi)SOD活性均呈現(xiàn)先升高后降低的峰值變化趨勢(shì)。在低pH組中，以pH 7.4時(shí)刺參體內(nèi)SOD活性最高，為(74.92±2.24) U/ml，與對(duì)照組相比，差異顯著(<0.05)，而pH 7.6、7.8組SOD活性均與對(duì)照組無(wú)顯著差異(>0.05)；在高pH組中，當(dāng)pH為8.6~8.8時(shí)，SOD活性顯著增加(<0.05)，以pH 8.8組刺參的SOD活性最高，為(72.90±1.10) U/ml，之后隨著pH升高SOD活性逐漸下降，但與對(duì)照組差異不顯著。

圖2 不同pH對(duì)刺參體內(nèi)SOD活性的影響

2.5 pH脅迫對(duì)刺參CAT活性的影響

不同pH對(duì)刺參體內(nèi)CAT活性的影響見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，隨著高、低pH脅迫程度的加強(qiáng)，刺參CAT活性均呈現(xiàn)先升高后降低的峰值變化趨勢(shì)。在低pH組中，pH=7.4時(shí)達(dá)到最高值，為(14.99±2.38) U/ml，各實(shí)驗(yàn)組刺參CAT活性均與對(duì)照組差異顯著(<0.05)；在高pH組中，pH=9.0時(shí)刺參體內(nèi)CAT活性達(dá)到最高，為(15.68±0.89) U/ml，之后隨著pH升高CAT活性繼而逐漸下降，各實(shí)驗(yàn)組刺參CAT活性均與對(duì)照組有顯著差異(<0.05)。

圖3 不同pH對(duì)刺參體內(nèi)CAT活性的影響

3 討論

3.1 pH對(duì)刺參存活的影響

在自然環(huán)境下，pH是隨著時(shí)間和空間變化而變化的環(huán)境理化因子，水生生物的存活、生長(zhǎng)和攝食與pH密切相關(guān)。不同的水生生物品種和發(fā)育階段適宜的pH不同，毛蚶()稚貝適宜的pH范圍為7.5~8.5 (方軍等, 2008)，中國(guó)明對(duì)蝦()生活在7.6~9.0的海水中最適宜(何玉英等, 2008)，黃顙魚(yú)()的適宜生存pH為5.2~7.6 (吳萍等, 2001)。本研究發(fā)現(xiàn)，刺參適宜生存的pH范圍與大多數(shù)海洋生物基本一致。在pH 7.4~9.0條件下，刺參生存狀況良好，實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)無(wú)死亡現(xiàn)象，是刺參生活的相對(duì)安全pH值范圍。但是，如果刺參生活環(huán)境pH值超過(guò)此范圍時(shí)，對(duì)刺參的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生極為不利的影響，致使刺參產(chǎn)生不同程度的應(yīng)激反應(yīng)。本研究表明，刺參適宜生活的水環(huán)境pH最高值不宜超過(guò)9.2，最低值不宜低于7.2，若超出此pH值范圍，持續(xù)時(shí)間均不宜超過(guò)6 d，否則會(huì)引起刺參的過(guò)度應(yīng)激反應(yīng)，引發(fā)吐腸、化皮、潰爛甚至病變或者死亡。

3.2 pH對(duì)刺參攝食和生長(zhǎng)的影響

環(huán)境因子在適宜的范圍內(nèi)變化，對(duì)水生生物存活和生長(zhǎng)影響不大，但超過(guò)了適宜的范圍就會(huì)產(chǎn)生抑制作用。水環(huán)境pH變化對(duì)水生生物是一種應(yīng)激，本研究發(fā)現(xiàn)，pH在適宜的范圍內(nèi)變化或者短時(shí)間內(nèi)變動(dòng)，對(duì)刺參攝食和生長(zhǎng)有一定的積極作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)pH在7.4~7.8范圍時(shí)，短時(shí)間內(nèi)(12 d)刺參出現(xiàn)生長(zhǎng)速率加快的現(xiàn)象，這說(shuō)明在一定范圍內(nèi)相對(duì)低pH對(duì)刺參生長(zhǎng)具有一定的積極作用。究其原因，可能是低濃度的H+降低了刺參腸道中的pH值，有利于創(chuàng)造出適合消化酶發(fā)揮活性的低pH環(huán)境，從而提高飼料的消化吸收來(lái)促進(jìn)刺參生長(zhǎng)。本研究結(jié)果與添加酸化劑對(duì)羅非魚(yú)()的促生長(zhǎng)效應(yīng)規(guī)律類(lèi)似(潘慶等, 2004)。但隨著pH脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)低濃度的pH增益效果逐漸消失，刺參生長(zhǎng)受到抑制，進(jìn)而出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)。在高pH環(huán)境中，當(dāng)pH高于8.8時(shí)，刺參表現(xiàn)為攝食量減少、消化能力差、排泄糞便不成形、個(gè)體出現(xiàn)明顯萎縮、肉刺呈圓鈍狀，整個(gè)體表逐漸變得平滑，生長(zhǎng)受到顯著抑制。本結(jié)果與在pH 8.5和pH 9.5水體中的鯽()生長(zhǎng)較慢的結(jié)果(李文祥等, 2011)相似。

本研究中，高、低pH條件對(duì)刺參生長(zhǎng)和攝食影響不同，反映出刺參對(duì)不同pH的耐受范圍不同。長(zhǎng)期處在pH脅迫環(huán)境中，一方面影響刺參對(duì)飼料的攝食和消化利用，另一方面使刺參機(jī)體大部分能量用于自身代謝進(jìn)行內(nèi)環(huán)境酸堿平衡調(diào)節(jié)，而用于生長(zhǎng)的能量大幅減少，這一研究結(jié)果與魚(yú)類(lèi)、甲殼類(lèi)水生動(dòng)物有相同的變化規(guī)律(洪美玲等, 2007; 李波等, 2011)。本研究結(jié)果表明，pH在7.6~8.8范圍內(nèi)，如果是在短時(shí)間內(nèi)變動(dòng)，其對(duì)刺參攝食和生長(zhǎng)影響不明顯，而若超出此范圍或者長(zhǎng)時(shí)間的脅迫，會(huì)對(duì)刺參生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用。

3.3 pH對(duì)刺參抗氧化酶活性的影響

刺參的免疫機(jī)制以非特異性免疫反應(yīng)為主，研究認(rèn)為，環(huán)境脅迫因子中諸如水體pH、溫度、鹽度等變化誘導(dǎo)的生理效應(yīng)可能經(jīng)由氧化還原途徑實(shí)現(xiàn)，即環(huán)境脅迫因子造成生物體有氧代謝異常，活性氧自由基大量積累而引起氧化損傷(Ryter, 2007)?？寡趸冈谇宄钚匝踝杂苫⒌钟趸瘬p傷方面發(fā)揮著重要作用。因此，可將抗氧化酶作為評(píng)估pH脅迫對(duì)生物體產(chǎn)生氧化脅迫效應(yīng)的一類(lèi)生物標(biāo)志物，而SOD和CAT是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，也是反映生物應(yīng)對(duì)各種脅迫的重要指標(biāo)(沙飛等, 2015)。SOD能將O2–催化歧化為H2O2和O2，H2O2在CAT的作用下分解成H2O和O2，從而聯(lián)合清除活性氧自由基，維持細(xì)胞和機(jī)體的正常活動(dòng)。

本研究中，在pH 7.4~8.8范圍內(nèi)，SOD活性隨著pH脅迫程度的升高逐漸上升，這說(shuō)明在此pH范圍脅迫下，刺參體內(nèi)的SOD能夠有效發(fā)揮防御作用，而超出此pH范圍，隨著pH脅迫強(qiáng)度的增強(qiáng)，當(dāng)大量產(chǎn)生的活性氧自由基超出刺參自身清除閾值時(shí)，SOD不能及時(shí)補(bǔ)充，導(dǎo)致SOD活性逐漸下降。CAT活性在pH 7.4~9.0范圍內(nèi)與SOD活性變化趨勢(shì)一致，這說(shuō)明SOD與CAT二者在功能上具有相對(duì)的獨(dú)立性，SOD被抑制后CAT會(huì)顯著提高(沙飛等, 2015)，二者聯(lián)合清除活性氧自由基，協(xié)同對(duì)機(jī)體進(jìn)行免疫保護(hù)。研究結(jié)果表明，當(dāng)pH低于7.4或高于9.0時(shí)，隨著pH脅迫程度的增強(qiáng)，當(dāng)抗氧化酶難以抵御大量產(chǎn)生的活性自由基時(shí)，刺參抗氧化酶SOD和CAT遭到破壞，機(jī)體持續(xù)受到氧化損傷，逐漸加劇細(xì)胞的變性或者死亡，進(jìn)而導(dǎo)致刺參的高死亡率，這一點(diǎn)與各實(shí)驗(yàn)組刺參存活率的變化結(jié)果一致。另外，其他環(huán)境脅迫因子如亞硝酸氮對(duì)刺參抗氧化酶的影響的研究與本研究結(jié)果類(lèi)似，如低于2.3 mg/L的亞硝酸氮脅迫在短期內(nèi)提高了SOD和CAT活性，而高于11.5 mg/L的亞硝酸氮脅迫卻抑制了SOD和CAT活性(陳蕓燕等, 2013)。

3.4 刺參對(duì)pH變化的生理適應(yīng)性

本研究發(fā)現(xiàn)，刺參在不同pH脅迫環(huán)境條件下，其存活、生長(zhǎng)、攝食等均受到不同影響，從宏觀角度直接反映出刺參對(duì)低pH環(huán)境相對(duì)于高pH環(huán)境的適應(yīng)性更強(qiáng)，其體內(nèi)抗氧化酶活性的變化趨勢(shì)與之基本一致。本研究結(jié)果表明，在刺參養(yǎng)殖水環(huán)境中，pH對(duì)刺參存活、攝食和生長(zhǎng)具有顯著影響，尤其是在刺參池塘養(yǎng)殖過(guò)程中，由于受溫度、鹽度、水體藻菌相失衡、底質(zhì)老化、滸苔等大型藻類(lèi)等因素的影響，池中pH常處于動(dòng)態(tài)變化中。因此，在刺參養(yǎng)殖過(guò)程中，科學(xué)調(diào)控水質(zhì)和底質(zhì)，穩(wěn)定水質(zhì)理化因子，顯得尤為重要，關(guān)系到刺參養(yǎng)殖的好壞和成敗。將刺參棲息生活的水環(huán)境pH保持在7.4~9.0范圍內(nèi)，更有利于刺參的生長(zhǎng)發(fā)育。

Chang YQ, Sui XL, Li J. The current situation, problem and prospect on theaquaculture. Fishery Science, 2006, 25(4): 198–201 [常亞青, 隋錫林, 李俊. 刺參增養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)狀、存在問(wèn)題與展望. 水產(chǎn)科學(xué), 2006, 25(4): 198–201]

Chen YY, Tian XL, Yu X,. Effects of nitrite stress on the non-specific immune response and HSP70 expression of sea cucumber. Periodical of Ocean University of China, 2013, 43(11): 35–42 [陳蕓燕, 田相利, 于曉, 等. 亞硝酸氮脅迫對(duì)刺參體壁非特異性免疫能力及HSP70表達(dá)的影響. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 43(11): 35–42]

Dong XL, Li CL, Zhao B,. Effects of low salinity stress on the activities of non-specific immune enzymes and antibacterial activity of sea cucumber. Progress in Fishery Sciences, 2013, 34(3): 82–87 [董曉亮, 李成林, 趙斌, 等. 低鹽脅迫對(duì)刺參非特異性免疫酶活性及抗菌活力的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2013, 34(3): 82–87]

Dong YW, Dong SL. Advances of ecological physiology in sea cucumber,Selenka. Periodical of Ocean University of China, 2009, 39(5): 908–912 [董云偉, 董雙林. 刺參對(duì)溫度適應(yīng)的生理生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 39(5): 908–912]

Fang J, Yan MC, Zhang JM,Preliminary studies on the effects of pH and ammonia on growth and survival tojuveniles. Journal of Zhejiang Ocean University (Natural Science), 2008, 27(3): 281–285 [方軍, 閆茂倉(cāng), 張炯明, 等. pH和氨氮對(duì)毛蚶稚貝生長(zhǎng)與存活影響的初步研究. 浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào), 2008, 27(3): 281–285]

Geng CF, Tian Y, Zhang YP,Effects of acute low salinity stress on the physiological indices of. Journal of Fishery Science of China, 2015, 22(4): 666–674 [庚辰帆, 田燚, 張宇鵬, 等. 低鹽脅迫對(duì)仿刺參相關(guān)生理指標(biāo)的影響. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2015, 22(4): 666–674]

He YY, Li J, Liu P,Comparison of the resistance to pH value an ammonia in Chinese shrimp () families. Periodical of Ocean University of China, 2008, 38(5): 761–765 [何玉英, 李健, 劉萍, 等. 中國(guó)對(duì)蝦家系幼體對(duì)氨氮和pH值的耐受性比較. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 38(5): 761–765]

Hong ML, Chen LQ, Gu SZ,. Effects of ammonia exposure on immunity indicators of haemolymph and histological structure of hepatopancreas in Chinese mitten carb (). Journal of Fishery Sciences of China, 2007, 14(3): 412–418 [洪美玲, 陳立僑, 顧順樟, 等. 氨氮脅迫對(duì)中華絨螯蟹免疫指標(biāo)及肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2007, 14(3): 412–418]

Hu W, Li CL, Zhao B,Effects of low salinity stress on survival, growth and feeding rate of sea cucumber. Progress in Fishery Sciences, 2012, 33(3): 92–97 [胡煒, 李成林, 趙斌, 等. 低鹽脅迫對(duì)刺參存活、攝食和生長(zhǎng)的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2012, 33(3): 92–97]

Li B, Fan QX, Yang K,. Effects of chronic ammonia stress on foraging, growth and haematological parameters of yellow catfish () juveniles. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2011, 17(6): 824–829 [李波, 樊啟學(xué), 楊凱, 等. 慢性氨氮脅迫對(duì)黃顙魚(yú)攝食?生長(zhǎng)及血液指標(biāo)的影響. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2011, 17(6): 824–829]

Li CL, Hu W. The development situation, trend and suggestions on theSelenka aquaculture industry of China. Marine Economy of China, 2017(1): 3–20 [李成林, 胡煒. 我國(guó)刺參產(chǎn)業(yè)發(fā)展?fàn)顩r、趨勢(shì)與對(duì)策建議. 中國(guó)海洋經(jīng)濟(jì), 2017(1): 3–20]

Li CL, Song AH, Hu W,. Status analysis and sustainable development strategy of sea cucumberSelenka aquaculture industry in Shandong Province. Progress in Fishery Sciences, 2010, 31(4): 126–132 [李成林, 宋愛(ài)環(huán), 胡煒, 等. 山東省刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀分析與可持續(xù)發(fā)展對(duì)策. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2010, 31(4): 126–132]

Li GR, Ren LH, Sun GH,. Effects of hypoxic stress on oxidative stress indices inProgress in Fishery Sciences, 2016, 37(5): 133–139 [李根瑞, 任利華, 孫國(guó)華, 等. 低溶氧脅迫對(duì)刺參()氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2016, 37(5): 133–139]

Li WX, Xie J, Song R,. Effects of pH stress on cortisol and non-specific immunity of. Acta Hydrobiologica Sinica, 2011, 35(2): 256–261 [李文祥, 謝駿, 宋銳, 等. 水體pH對(duì)異育銀鯽皮質(zhì)醇激素和非特異性免疫的影響. 水生生物學(xué)報(bào), 2011, 35(2): 256–261]

Pan Q, Tan YG, Bi YZ,Effects of acid supplement on growth and feed utilization in tilapia′. Journal of Fisheries of China, 2004, 28(6): 682–688 [潘慶, 譚永剛, 畢英佐, 等. 酸制劑對(duì)羅非魚(yú)生長(zhǎng)和飼料利用的影響. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2004, 28(6): 682–688]

Ryter SW, Kim HP, Hoetzel A,. Mechanisms of cell death in oxidative stress. Antioxidants & Redox Signaling, 2007, 9(1): 49–89

Sha F, Chang YQ, Ding J. Effects of two cooling modes of low temperature stress on antioxidant enzyme activities and malondiadehyde level in sea cucumberJournal of Dalian Ocean University, 2015, 30(1): 25–29 [沙飛, 常亞青, 丁君. 兩種降溫模式的低溫脅迫對(duì)刺參抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響. 大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 30(1): 25–29]

Wu P, Cao ZH, Yang LR,. Effects of pH on survival and growth to yellow catfish). Reservoir Fisheries, 2001, 21(6): 3–6 [吳萍, 曹振華, 楊立榮, 等. pH對(duì)黃顙魚(yú)生存和生長(zhǎng)的影響. 水利漁業(yè), 2001, 21(6): 3–6]

Yuan XT, Yang HS, Wang LL,. Effects of salinity on energy budget in pond-cultured sea cucumber(Selenka). Aquaculture, 2010, 306: 348–351

Zang YQ, Tian XL, Dong SL,. The activities of immunoenzymes and heat shock protein 70 content of sea cucumber,(Selenka) to chronic stress of ammonical nitrogen. Periodical of Ocean University of China, 2012, 42: 60–66 [臧元奇, 田相利, 董雙林, 等. 氨氮慢性脅迫對(duì)刺參免疫酶活性及熱休克蛋白表達(dá)的影響. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 42: 60–66]

Zeng YY, Ai CX, Liu JG,. Effects of pH on some immune factors of mud crab,. Journal of Xiamen University (Natural Science), 2008, 47(3): 413–418 [曾媛媛, 艾春香, 劉建國(guó), 等. pH脅迫對(duì)擬穴青蟹體內(nèi)幾種免疫因子的影響. 廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2008, 47(3): 413–418]

Zhao B, Hu W, Li CL,The effects of low salinity on the growth and activities of digestive enzymes in sea cucumberProgress in Fishery Sciences, 2015, 36(1): 91–96 [趙斌, 胡煒, 李成林, 等. 低鹽環(huán)境對(duì)3種規(guī)格刺參()幼參生長(zhǎng)與消化酶活力的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2015, 36(1): 91–96]

Zhao W, Liang M, Zhang P. Effect of yeast polysaccharide on the immune function of juvenile sea cucumber,Selenka under pH stress. Aquaculture International, 2010, 18(5): 777–786

Zhao XY, Li J, Chen P,. Effects of pH stress on survival rate and activities of ion-transport enzyme, immune-related enzymes in three species of shrimps. Journal of Shanghai Ocean University, 2011, 20(5): 720–728 [趙先銀, 李健, 陳萍, 等. pH脅迫對(duì)3種對(duì)蝦存活率、離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶和免疫酶活力的影響, 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 20(5): 720–728]

Effects of pH Stress on Survival Rate, Growth and Antioxidant Enzyme Activities of the Sea Cucumber,Selenka

HAN Sha1, HU Wei1, LI Chenglin1①, ZHU Xibo2, ZHAO Bin1, ZHANG Shaochun1, SUN Yongjun3

(1. Marine Biology Institute of Shandong Province, Qingdao 266104; 2. Extension Station of Fishery Technology of Lanshan District, Rizhao 276800; 3. Haodangjia Group Corporation, Weihai 264300)

pH is an important environmental factor affecting the survival, growth, and immunity of aquatic animals. In general, alteration of environmental conditions often results in pH fluctuation in the aquaculture water ofSelenka. However, little is known about the physiological response of sea cucumbers under pH stress. Therefore, the survival rate, growth, and antioxidant enzyme activities of sea cucumbers (7.02±0.81 g) were analyzed under different pH (control group, pH=8.4), low pH (pH 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, and 7.8), high pH (pH 8.6, 8.8, 9.0, 9.2, 9.4, and 9.6)) stress for 36 days. The survival rate of sea cucumbers decreased gradually with pH intension increasing and time extension, which in the groups ranging from pH 7.4 to pH 9.0 were 100%. There appeared to be a stress response and then death of individuals in the groups of pH 6.8, 7.0 and 9.6 from the third day, in which the whole group of sea cucumbers died after 30 days. Under different pH stress, the growth of the sea cucumbers differed significantly. The specific growth rate decreased with pH intension increasing and growth was negative growth in the group of pH 9.0. The superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activity of sea cucumbers among the pH treatment groups increased and was significantly higher than those of the control group, which increased at first and then decreased with pH intension increasing. The activity of SOD and CAT of sea cucumber in low pH groups increased to (74.92±2.24) U/ml and (14.99±2.38) U/ml peaking at pH 7.4, which was significantly higher than the control group. While in high pH groups, the activity of SOD and CAT of sea cucumber increased to (72.90±1.10) U/ml and (15.68±0.89) U/ml, peaking at pH 8.8 and pH 9.0 respectively. The results indicate that the pH range from 7.4 to 9.0 is appropriate for survival and growth of sea cucumbers, otherwise stress responses and even death of sea cucumbers are imminent.

Selenka; pH; Survival; Growth; Antioxidant enzyme

* 泰山產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才工程(LJNY201613)、山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系刺參產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)工程(SDAIT-22-01; SDAIT-22-05)、山東省農(nóng)業(yè)良種工程、山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2014GNC111022)和山東省星火科技示范項(xiàng)目(2015XH006)共同資助[This work was supported by Taishan Industry Leading Talents Project (LJNY201613), Sea Cucumber Innovation Team of Shandong Province Agriculture Research System (SDAIT-22-01, SDAIT-22-05), Agriculture Seed Project of Shandong Province, Science and Technology Development Project of Shandong Province (2014GNC111022), and Spark Program of Shandong Province (2015XH006)]. 韓 莎，E-mail: shahan_2012@163.com

李成林，研究員，E-mail: lcl_xh@hotmail.com

LI Chenglin, E-mail: lcl_xh@hotmail.com

2017-08-22,

2017-10-26

10.19663/j.issn2095-9869.20170822001

韓莎, 胡煒, 李成林, 朱夕波, 趙斌, 張少春, 孫永軍. pH脅迫對(duì)刺參存活、生長(zhǎng)及抗氧化酶活性的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(5): 91–98 Han S, Hu W, Li CL, Zhu XB, Zhao B, Zhang SC, Sun YJ. Effects of pH stress on survival rate, growth and antioxidant enzyme activities of sea cucumber, Apostichopus japonicus Selenka. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(5): 91–98

S917.4

A

2095-9869(2018)05-0091-08

(編輯 馮小花)