林穎輝 王文磊 徐 燕 紀(jì)德華 陳昌生 謝潮添

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壇紫菜絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及表達(dá)特征*

林穎輝 王文磊 徐 燕 紀(jì)德華 陳昌生 謝潮添①

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廈門 361021)

絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)在植物應(yīng)答逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用。本研究以壇紫菜()為研究材料，采用普通PCR技術(shù)克隆得到2條壇紫菜的全長基因序列，分別命名為(GenBank收錄號：MF687405)和(GenBank收錄號：MF687406)。其中，序列全長1710 bp，包含一個1491 bp的開放閱讀框，所編碼的多肽包含497個氨基酸，分子量為121.443 kDa，等電點為4.93；序列全長1957 bp，包含一個1395 bp的開放閱讀框，所編碼的多肽包含465個氨基酸，分子量為113.969 kDa，等電點為4.95。多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果確認(rèn)和基因?qū)儆诨蚣易濉RT-PCR定量分析結(jié)果表明，高溫脅迫條件下，2條基因的表達(dá)模式基本一致，均表現(xiàn)為先上調(diào)后下調(diào)再上調(diào)的趨勢，這說明基因可能在壇紫菜應(yīng)答高溫脅迫過程中發(fā)揮作用。

壇紫菜；高溫脅迫；絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶；活性氧；基因克隆

絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(Serine hydroxyl methyl- transferase, SHMT)(Schirch, 2005)廣泛存在于真核生物和原核生物中，在高等植物的一碳化合物代謝和光呼吸過程發(fā)揮著重要作用，其主要功能是為蛋白質(zhì)和嘌呤的生物合成提供甘氨酸，并生成N5,N10-亞甲基四氫葉酸(McClung, 2000)。四氫葉酸是植物體內(nèi)參與C1轉(zhuǎn)移反應(yīng)的重要輔酶，并且在植物的甲基循環(huán)過程中發(fā)揮重要作用(Bekaert, 2008)。生成的亞甲基四氫葉酸參與了DNA和RNA的合成，并在亞甲基四氫葉酸還原酶的作用下，再經(jīng)過一系列的轉(zhuǎn)化，最終生成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine, SAM)，從而直接參與DNA的甲基化過程(Du, 2017)。植物在缺少SHMT時，會發(fā)生嚴(yán)重的生長延遲。同時，已有的研究也表明，SHMT在植物抵抗非生物脅迫時也發(fā)揮著重要的作用。例如，谷胱甘肽是清除活性氧的重要抗氧化劑，而谷胱甘肽的合成主要依賴于甘氨酸(Graham, 1997; 李朝霞等, 2003)。Graham等(1997)對楊樹在逆境脅迫下谷胱甘肽合成的研究中發(fā)現(xiàn)，基因參與了光呼吸過程并產(chǎn)生甘氨酸。李朝霞等(2003)認(rèn)為，在逆境脅迫條件下，光呼吸不僅可以促進(jìn)卡爾文循環(huán)參與抗逆反應(yīng)，而且可以參與甘氨酸的合成進(jìn)而合成谷胱甘肽清除活性氧。此外，對擬南芥SHMT突變體的研究表明，抑制基因的表達(dá)，植株抵抗非生物脅迫的能力顯著下降，更易受到脅迫的侵害(Moreno, 2005)。由此可見，基因在植物的逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。因此，研究逆境脅迫條件下植物體中基因的表達(dá)變化并應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炛?，是抗逆植物基因工程研究的一個重要方向。

壇紫菜()是我國南方沿海廣泛栽培的大型經(jīng)濟(jì)海藻之一，其產(chǎn)量占全國紫菜產(chǎn)量的70%以上(李曉川, 2011)。壇紫菜生活在潮間帶的中高潮區(qū)，退潮時，壇紫菜葉狀體會直接暴露于空氣當(dāng)中，遭遇高溫、失水和高光強(qiáng)等環(huán)境因子的逆境脅迫。由于生存環(huán)境特殊，使得壇紫菜具備了獨特的抵抗逆境脅迫的能力(Blouin, 2011)。此外，近年來受到全球氣候變暖的影響，海水水溫過高嚴(yán)重影響壇紫菜栽培的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益(Xu Y, 2014; 李兵等, 2013; 張元等, 2011)。因此，研究壇紫菜的抗高溫機(jī)制，克隆抗高溫相關(guān)基因，對于后期海藻乃至經(jīng)濟(jì)作物抗逆基因工程的研究具有十分重要的理論價值和實際意義。目前，尚無在大型海藻中克隆獲得相關(guān)基因的報導(dǎo)，研究基因在抵抗高溫等逆境脅迫時如何發(fā)揮作用，對于研究大型海藻在抵抗逆境脅迫時的一碳化合物代謝和光呼吸變化十分必要。本研究克隆獲得了2條壇紫菜基因的全長，并通過實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR)技術(shù)分析基因在高溫脅迫下的表達(dá)水平變化，不僅豐富了壇紫菜的基因庫，而且可為壇紫菜抗逆機(jī)制研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 壇紫菜樣品及脅迫處理

本實驗中所采用的實驗材料取自福建省壇紫菜種質(zhì)資源庫，Z-61品系是經(jīng)人工誘變和雜交選育出的壇紫菜耐高溫純系(陳昌生等, 2008)。正常條件下培養(yǎng)的壇紫菜Z-61葉狀體用于總RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行相關(guān)基因的全長克隆。提取各高溫脅迫下培養(yǎng)的Z-61葉狀體總RNA，用于基因表達(dá)水平的qRT-PCR分析。

壇紫菜Z-61葉狀體的正常培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度(21.0±0.5)℃，光照強(qiáng)度50~60 μmol/(m2·s)，光照周期12L∶12D，每48 h更換一次新鮮的葉狀體培養(yǎng)液。葉狀體葉片長度培養(yǎng)至(16±2) cm時，選取葉面平滑、無卷曲且生長狀況良好的藻體作為實驗材料。

壇紫菜Z-61葉狀體的高溫脅迫培養(yǎng)條件：取(16± 2) cm的健康藻體，分別于(31.0±0.5)℃的恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行高溫脅迫處理(其余培養(yǎng)條件同適宜條件)，脅迫處理時間為0、3、6、12、24、48、96、144 h。

1.2 引物及其序列

基因序列的PCR擴(kuò)增、陽性克隆篩選和不同脅迫處理下基因表達(dá)水平分析所用的引物序列均由廈門鉑尚生物有限公司合成(表1)。

1.3 總RNA的分離純化

用濾紙吸干壇紫菜表面水分后，稱取0.1 g藻體用于總RNA提取?？俁NA提取采用E.Z.N.A植物RNA提取試劑盒(OMEGA, 德國)。所提取的總RNA的完整性通過凝膠電泳進(jìn)行檢查，并通過Cary50紫外分光光度計(Varian, 美國)分別測定OD260 nm和OD280 nm值。根據(jù)測定結(jié)果判斷核酸和蛋白質(zhì)的污染情況，并計算所提取的RNA濃度。

表1 實驗中所用引物

Tab.1 Primers used in the experiment

1.4 PhSHMT基因的全長克隆

根據(jù)壇紫菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(GenBank登錄號：GFOM00000000)unigene的注釋結(jié)果，篩選出2條注釋結(jié)果為皺波角叉菜()基因的unigene(Cluster-3452.15441，Cluster-3452.16340)序列，進(jìn)行基因的克隆。通過Blast序列比對分析，發(fā)現(xiàn)Unigene15441已包含所編碼基因5￠端起始密碼子和3￠端終止密碼子，因此，根據(jù)Unigene15441的序列設(shè)計普通PCR引物進(jìn)行序列擴(kuò)增驗證(表1)；而對Unigene16340進(jìn)行Blast比對，同樣也已包含了5￠端起始密碼子和3￠端終止密碼子，因此，同樣根據(jù)Unigene16340序列設(shè)計普通PCR引物進(jìn)行序列擴(kuò)增驗證(表1)。采用普通PCR方法對壇紫菜基因進(jìn)行克隆。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后使用通用型DNA純化回收試劑盒(TIANGEN)對目的片段進(jìn)行回收，與pMD19-T載體(TaKaRa)連接后導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，篩選出陽性克隆后進(jìn)行放大培養(yǎng)，采用質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN)提取質(zhì)粒后寄送廈門鉑尚生物工程有限公司測序。根據(jù)測序結(jié)果，獲得2個基因全長序列。

1.5 PhSHMT基因的生物信息學(xué)分析

基因序列同源性檢測：利用NCBI的Blastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)程序?qū)λ@得的全長基因序列進(jìn)行檢測。

開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)分析：采用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf. html)軟件分析基因的開放閱讀框以及其所編碼氨基酸序列。

蛋白質(zhì)序列一級結(jié)構(gòu)分析：使用在線軟件ExPASy ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析基因所編碼蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。

蛋白質(zhì)序列二級結(jié)構(gòu)分析：使用在線軟件PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)分析基因所編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。

蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)分析：通過在線軟件TMHMM Serverv.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析基因所編碼蛋白質(zhì)是否存在跨膜結(jié)構(gòu)域。

亞細(xì)胞定位預(yù)測：通過在線軟件WoLFPSORT (http://www.wolfpsort.org/)對基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

采用ClustalX進(jìn)行氨基酸多重序列比對，并采用MEGA 6.06軟件最大似然法(Maximum Likelihood, ML)構(gòu)建蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 PhSHMT基因表達(dá)水平的qRT-PCR分析

根據(jù)已獲得的基因序列設(shè)計熒光定量PCR引物(表1)，并以作為內(nèi)參基因，分別進(jìn)行在不同高溫脅迫條件下基因表達(dá)水平的qRT-PCR分析。

提取的各樣品總RNA按PrimeScript RtreagentKit (TaKaRa, 大連)的流程將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA定量模板。qRT-PCR擴(kuò)增以10×梯度稀釋的cDNA為模板進(jìn)行，用于制作、和內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個反應(yīng)設(shè)3個平行復(fù)孔。通過SPSS 19.0和Excel軟件對實驗最終定量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，并采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)比較不同數(shù)據(jù)組間的差異(＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示極顯著差異)。

qRT-PCR擴(kuò)增的20 μl反應(yīng)體系：10 μl 2×SYBR PremixTMⅡ(TaKaRa)，6.8 μl ddH2O，0.4 μl Rox Reference DyeⅠ，0.4 μl正反向引物和2 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。擴(kuò)增程序：95℃變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 31 s，40個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后從55℃緩慢升溫至95℃，繪制熔解曲線。qRT-PCR擴(kuò)增在7300型定量PCR儀(ABI, 美國)上進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 PhSHMT基因的全長克隆及序列分析

以壇紫菜Cluster-3452.15441為核心序列，通過普通PCR擴(kuò)增和測序獲得一條1710 bp的基因序列(圖1)。經(jīng)過Blast比對，確定該基因為壇紫菜的基因，命名為。該基因已提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，收錄號為MF687405。通過ORF Finder在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，該基因107~1598個堿基為完整的開放閱讀框。使用ExPASy ProtParam程序進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，編碼的蛋白質(zhì)包含497個氨基酸，分子式為C4235H6978N1494O1762S450，分子量為121.443 kDa，理論等電點為4.93，不穩(wěn)定系數(shù)為48.77，脂肪系數(shù)為17.60，總平均疏水度為0.807。通過Predict Protein程序預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)中構(gòu)成螺旋(H)、片層(E)和環(huán)狀(L)的氨基酸殘基占總氨基酸比例分別為43.46%、12.68%和34.00%。TMHMM軟件檢測發(fā)現(xiàn)該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域，亞細(xì)胞定位軟件WoLFPSORT預(yù)測定位于線粒體中。

以壇紫菜Cluster-3452.16340為核心序列，通過普通PCR擴(kuò)增和測序獲得一條1957 bp的基因序列(圖1)。經(jīng)過blast比對，確定該基因為壇紫菜的基因，命名為。該基因已提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，收錄號為MF687406。通過ORF Finder在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，該基因269~1664個堿基為完整的ORF。使用ExPASy ProtParam程序進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，基因編碼的蛋白質(zhì)包含465個氨基酸，分子式為C3992H6588N1398O1670S408，分子量為113.969 kDa，理論等電點為4.95，不穩(wěn)定系數(shù)為51.09，脂肪系數(shù)為17.60，總平均疏水度為0.775。通過Predict Protein程序預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)中構(gòu)成螺旋(H)、片層(E)和環(huán)狀(L)的氨基酸殘基占總氨基酸比例分別為43.23%%、16.34%%和29.46%%。TMHMM軟件檢測發(fā)現(xiàn)，該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域，亞細(xì)胞定位軟件WoLFPSORT預(yù)測定位于細(xì)胞質(zhì)中。

圖1 PhSHMT基因克隆產(chǎn)物電泳

1:普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物; 2:普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物; M: DL2000 DNA marker

1: PCR products of; 2: PCR products of; M: DL2000 DNA marker

多序列比對結(jié)果表明，PhSHMT-1和PhSHMT-2間同源性較高，且都具有SHMT家族特有的保守結(jié)構(gòu)域，在PhSHMT-1和PhSHMT-2序列中均發(fā)現(xiàn)了磷酸吡哆醛的結(jié)合位點(圖2)，說明SHMT是以磷酸吡哆醛作為輔酶進(jìn)行反應(yīng)的。

圖2 PhSHMT蛋白氨基酸序列的多重序列比對

下劃線部分為基因家族特有的保守結(jié)構(gòu)域，陰影標(biāo)記為磷酸吡哆醛的結(jié)合位點，“*”和“：”分別表示一致性和相似性的氨基酸殘基

The underlined sections were the conserved amino acids motif ofgene family. The gray background were marked as the pyridoxal phosphate binding site. Asterisks (*) and colons (:) indicated identical and similar amino acid residues, respectively

2.2 PhSHMT的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為進(jìn)一步分析與其他物種的親緣關(guān)系，從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中選取10條SHMT相關(guān)氨基酸序列，通過MEGA 6.06程序采用最大似然法(Maximum likelihood, ML)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，基因與一種紅藻()和鄒波角叉菜()聚為一類，而與三角褐指藻()、一種溫泉紅藻()和假微型海鏈藻()聚為一類，且藻類的基因與高等植物遺傳距離較大(圖3)，說明藻類中基因與高等植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 SHMT基因的蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 PhSHMT基因表達(dá)水平的qRT-PCR分析

為研究基因在壇紫菜響應(yīng)逆境脅迫中所發(fā)揮的功能，本研究對基因表達(dá)水平進(jìn)行了定量檢測。通過qRT-PCR技術(shù)對2條基因在高溫脅迫下的表達(dá)特征進(jìn)行了相對定量分析(圖4、圖5)。

圖4 PhSHMT-1在高溫脅迫水平下的相對表達(dá)

具有不同字母上標(biāo)的數(shù)據(jù)間差異顯著(<0.05)，下同

Bar of each column with different small letters mean significant difference (<0.05). The same as below

結(jié)果表明，在31℃高溫脅迫不同時間下，和基因的表達(dá)模式基本一致：在高溫脅迫12 h時，和基因的表達(dá)水平受到高溫刺激，表達(dá)水平顯著上調(diào)(<0.05)；當(dāng)高溫脅迫超過12 h后，和基因可能已適應(yīng)高溫過程，表達(dá)水平恢復(fù)到正常值；當(dāng)高溫脅迫超過4 d時，和基因的表達(dá)水平又顯著上調(diào)(<0.05)，這可能是由于過久的高溫脅迫，藻體需要更多的谷胱甘肽以清除活性氧，而藻體中的甘氨酸通過合成谷胱甘肽導(dǎo)致含量下降，需要重新合成更多的甘氨酸。

圖5 PhSHMT-2在高溫脅迫下的相對表達(dá)

3 討論

甘氨酸作為一種植物抗逆調(diào)節(jié)劑，通過合成谷胱甘肽來清除活性氧(Yan, 2013)。植物可以通過光呼吸過程將絲氨酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸(馬莉等, 2008)，而SHMT在植物光呼吸過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，如果將基因敲除，植株的抗逆能力明顯降低，更容易受到活性氧的毒害(Moreno, 2005)。不僅如此，SHMT在光呼吸過程產(chǎn)生的四氫葉酸可以進(jìn)一步生成SAM，其可以調(diào)控CpG島胞嘧啶DNA的甲基化(Kim, 2005)。然而，目前對于大型海藻中基因的研究尚處于空白。本研究以轉(zhuǎn)錄組測序獲得的基因序列為基礎(chǔ)，通過普通PCR擴(kuò)增技術(shù)成功克隆了2條壇紫菜的基因。

植物在逆境脅迫下會導(dǎo)致卡爾文循環(huán)障礙，并產(chǎn)生大量的活性氧，對植物機(jī)體結(jié)構(gòu)造成氧化損傷(Mittler, 2002)。而光呼吸可以促進(jìn)卡爾文循環(huán)進(jìn)而提高植物抵抗逆境脅迫的能力，并且光呼吸過程的代謝中間產(chǎn)物也發(fā)揮了重要作用(趙宏偉等, 2016)，如脯氨酸與谷胱甘肽。其中，脯氨酸是一種重要的細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)劑，其合成主要受到谷氨酸含量的影響，而光呼吸過程產(chǎn)生的NH3參與了谷氨酸的合成。谷胱甘肽是一種重要的抗氧化物質(zhì)，在清除活性氧方面扮演著重要角色，谷胱甘肽的合成主要依賴于甘氨酸，而甘氨酸是光呼吸過程的重要代謝產(chǎn)物。SHMT作為一類參與光呼吸與一碳代謝的重要酶類，目前已經(jīng)在許多物種中被鑒定出。植物體內(nèi)存在3種形式的SHMT，包括細(xì)胞質(zhì)cSHMT、線粒體mSHMT和葉綠體SHMT(Bauwe, 2003; Garrow, 1993)。在本研究中，對克隆出的2條基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，基因定位于線粒體上，而基因定位于細(xì)胞質(zhì)上。這說明，壇紫菜中可能存在細(xì)胞質(zhì)型和線粒體型的SHMT，而是否存在葉綠體型的SHMT尚待進(jìn)一步的研究。根據(jù)以往的研究(Kamalay, 1980、1984)推測：壇紫菜線粒體型的SHMT首先在光呼吸過程發(fā)揮作用，將甘氨酸分解形成CO2和NH3，進(jìn)而生成絲氨酸；而隨著絲氨酸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中被分解，壇紫菜細(xì)胞質(zhì)型的SHMT又將絲氨酸催化生成甘氨酸。

植物在應(yīng)對逆境脅迫時的響應(yīng)是一個非常復(fù)雜的生理生化過程，其中包括了多種基因、多種生理機(jī)制的共同調(diào)控。植物在遭受高溫脅迫時會產(chǎn)生大量的活性氧，在植物長期的演變過程中形成了一系列復(fù)雜的活性氧清除機(jī)制，例如激活抗氧化酶基因的表達(dá)和增強(qiáng)抗氧化酶活性等。壇紫菜的早期研究發(fā)現(xiàn)，壇紫菜在應(yīng)對高溫脅迫時，其過氧化氫酶基因會在短時間內(nèi)迅速大幅度上調(diào)表達(dá)以清除細(xì)胞內(nèi)多余的過氧化物(仵燕青, 2016)；此外，谷胱甘肽過氧化物酶基因在12 h時顯著上調(diào)表達(dá)(張晗晗等, 2016)。本研究發(fā)現(xiàn)，在31℃高溫脅迫條件下，隨著脅迫時間的增加，壇紫菜2條基因均表現(xiàn)出先上調(diào)后下調(diào)再上調(diào)的趨勢，在高溫脅迫時間為12 h時，2條基因的表達(dá)水平均達(dá)到最高；隨著脅迫時間的增加，2條基因的表達(dá)水平下降，在高溫脅迫時間為4 d時，2條基因表達(dá)水平又顯著上調(diào)。通過以上結(jié)果可以推測：壇紫菜在高溫脅迫下，光呼吸通過促進(jìn)卡爾文循環(huán)參與到抗逆反應(yīng)中，光呼吸代謝的許多中間產(chǎn)物在這個階段也發(fā)揮了重要作用。光呼吸過程產(chǎn)生甘氨酸，甘氨酸通過合成谷胱甘肽來清除多余的活性氧?；蜃鳛橹参锕夂粑^程中關(guān)鍵的基因，在高溫脅迫下通過大量的上調(diào)表達(dá)以促進(jìn)光呼吸過程，進(jìn)而產(chǎn)生更多甘氨酸用于合成谷胱甘肽來清除多余的氧化活性物質(zhì)。在這個過程中可能伴隨壇紫菜甲基化的過程：高溫引起基因的大量上調(diào)表達(dá)，這個過程中不僅可以合成甘氨酸用以應(yīng)對高溫脅迫，還產(chǎn)生大量的四氫葉酸。由于四氫葉酸參與SAM的合成(Du, 2017)，高溫脅迫下，推測可能伴隨著壇紫菜甲基化水平的上升，這與許多物種在高溫條件下甲基化水平變化相似(Naydenov, 2015; Xu, 2014; 胡能兵等, 2016){胡能兵, 2016 #149}{胡能兵, 2016 #149}{胡能兵, 2016 #149}{胡能兵, 2016 #149}{胡能兵, 2016 #149}{胡能兵, 2016 #149}，但該推測還需要進(jìn)一步的實驗進(jìn)行驗證。

基因作為植物中一類響應(yīng)逆境脅迫的基因，在壇紫菜響應(yīng)高溫脅迫時發(fā)揮了重要的作用。SHMT可以通過參與植物體中谷胱甘肽的合成，以清除高溫脅迫條件下產(chǎn)生的活性氧，維持壇紫菜細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)環(huán)境。因此，本研究為理解壇紫菜的耐高溫機(jī)制以及耐高溫品系的培育提供了新的視野和理論基礎(chǔ)。

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Cloning and Expression Analysis of Serine Hydroxyl Methyltransferase (SHMT) Genes from

LIN Yinghui, WANG Wenlei, XU Yan, JI Dehua, CHEN Changsheng, XIE Chaotian①

(College of Fisheries, Jimei University, Xiamen 361021)

Serine hydroxyl methyltransferase (SHMT) plays an important role in plant response to stress. Under adversity stress, thegene not only promotes the Calvin cycle to participate in the anti-stress reaction, but also participates in the synthesis of glycine, and then synthesis of glutathione, scavenging reactive oxygen species., naturally grows in the coastal intertidal zone, is an important economic macroalgae in Fujian, Zhejiang and Guangdong provinces. Because of the special living environment,has the unique ability to resist adversity. With global warming, the temperature of seawater increases, which causes damage to seedlings ofand leads to great economic losses in the aquaculture industry. As for the physiological and molecular response ofto high temperature and dehydration stress conditions, our previous studies foundplays an important role in stress resistance. In this study, based on unigene sequences which were obtained from whole transcriptome sequencing of, two full-lengthgenes were obtained by ordinary PCR, and named(GenBank accession No:MF687405) and(GenBank accession No:MF687406). The full-length cDNA of thegene comprised 1710 nucleotides and contained an open reading frame (ORF) of 1491 bp, encoding a protein of 497 amino acid residues, with the predicted molecular weight of 121.443 kDa and theoretical isoelectric point of 4.93; and the full-length cDNA of thegene comprised 1957 nucleotides and contained an ORF of 1395 bp, encoding a protein of 465 amino acid residues with the predicted molecular weight of 113.969 kDa and theoretical isoelectric point of 4.95.Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis indicated that theandbelong to the plantenzyme family.The expressions of the twogenes, as measured by real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR), were consistent under high temperature stress. During high-temperature stress, the expression levels of the twogenes were significantly upregulated first and then decreased, but as the high-temperature stress continued, the expression levels were upregulated again. Results suggested that the gene ofenzyme plays an important role in responses ofto high-temperature stress.

; High temperature stress; Serine hydroxyl methyltransferase; Active oxygen; Gene cloning

* 福建省自然科學(xué)基金(杰青)(201412260001)資助 [This work was supported by the Natural Science Foundation of Fujian Province, China (Outstanding Youth Fund) (201412260001)]. 林穎輝，E-mail: 414350177@qq.com

謝潮添，教授，E-mail: ctxie@jmu.edu.cn

XIE Chaotian, E-mail: ctxie@jmu.edu.cn

2017-08-08,

2017-08-29

10.19663/j.issn2095-9869.20170808001

林穎輝, 王文磊, 徐燕, 紀(jì)德華, 陳昌生, 謝潮添. 壇紫菜絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及表達(dá)特征. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(5): 122–129 Lin YH, Wang WL, Xu Y, Ji DH, Chen CS, Xie CT. Cloning and expression analysis of serine hydroxyl methyltransferase (SHMT) genes from. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(5): 122–129

S968.43+1

A

2095-9869(2018)05-0122-08

(編輯 馮小花)