趙 燁，趙亞玲，周 軍，鄭 直

(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 生物化學與分子生物學系， 北京 100005)

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)被認為是疾病易感性和藥物反應的決定因素[1]，約有105個SNP分子標記被用于基因功能及疾病相關性研究[2]。此類研究需要簡單而低成本的方法來獲得大規(guī)模的核酸。當前的樣品類型多源于血液，需要提取核酸。血液采集需要專業(yè)人員及特殊器材，還可能引起一些潛在的病源傳播。大量核酸提取費時費力，成本高不易開展。目前在大規(guī)模SNP基因分型上仍無一種可用于無創(chuàng)性樣品的高效簡便的核酸獲取方式。故建立一種無創(chuàng)性且免核酸提取的多重SNP基因分型技術具有很大的應用價值。

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)缺乏癥的實質(zhì)是G6PD發(fā)生單堿基錯義突變導致的酶活性降低[3]。瘧疾流行國家G6PD 缺乏癥發(fā)病率高達8%[4]，而抗瘧藥伯氨喹啉(primaquine)可誘發(fā)G6PD 缺乏癥患者發(fā)生溶血[5]。進行G6PD突變型篩查可為伯氨喹啉的使用提供預先風險評估。本研究將以G6PD SNP檢測作為應用對象，建立適用于無創(chuàng)性樣品免核酸提取的多重SNP基因分型技術。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品：包括來自健康受試者的的血液，唾液及口腔拭子，及來自中緬邊境7例間日瘧口腔拭子樣品。所有樣品均獲得倫理委員會審批及受試者知情同意。

1.1.2 主要試劑：唾液及口腔拭子DNA提取試劑盒、血液DNA提取試劑盒、蛋白酶K， T4 DNA ligase(北京康為世紀生物科技有限公司)；Spectro CHIP芯片和樹脂試劑盒、iPLEX Gold試劑盒(Agena Bioscienc公司)；T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA polymerase、dNTP(New England Biolabs，NEB公司)；EasyTaq DNA polymerase (北京全式金生物技術有限公司)；牛血清白蛋白(北京鼎國昌盛生物有限公司)；裂解液(Affymetrix公司)；捕獲板、洗液(Diacutate公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集：保證受試者在過去30 min內(nèi)沒有進食，飲水，抽煙等。唾液采集之前用舌頭刮上下顎10～15次保證脫落細胞的數(shù)量，后將唾液收集于2 mL 離心管內(nèi)；收集口腔拭子時，持口腔采樣棉簽在內(nèi)壁黏膜旋轉 10～15 圈，然后再上下移動刮拭5～10次，力度適中，以緊貼口腔內(nèi)壁黏膜為宜，確保拭子各處都能蘸取口腔黏膜脫落細胞，剪去拭子多余木棒部分，置于2 mL離心管內(nèi)。

1.2.2 G6PD序列以及23個SNP位點選?。翰捎肎6PD的cDNA在GenBank中序列標識符為X03674(version:X03674.1 GI:31542)，檢測中國人中最常見的G6PD的23個突變位點[6]。

1.2.3 無創(chuàng)性免提取核酸的多重SNP分型法：每100 μL裂解體系包括：裂解液33.3 μL(3X)、蛋白酶K 5 μL(20 mg/mL)，探針混合物1 μL(0.1 mmol/L)、反向通用引物2 μL(0.1 mmol/L)、樣品(18～58 μL唾液/一個口腔拭子)和去離子水，56 ℃劇烈搖動30 min進行裂解反應。后將裂解產(chǎn)物轉移至捕獲板中98 ℃加熱5 min后55 ℃過夜孵育完成捕獲反應。結合基于延伸連接的多重探針擴增(multiplex extension and ligation-based probe amplification,MELPA)技術[6]對模板進行信號放大。最后進行單堿基引物延伸及質(zhì)譜分析。質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用MassARRAY?分子量陣列技術TyperAnalyzer軟件4.0版(Agena Bioscience公司)進行分析。每次實驗設4個樣品，每個樣品做3個重復對G6PD 23個SNP位點進行檢測。統(tǒng)計每個分型結果可信度等級，分為A、B、C和D級(A:conservative、 B:moderate、C:aggressive、 D:low probability)，可信度依次遞減[7]。可信度等級為A，B或C表示SNP檢測獲得成功，成功率(call rate)表示所有樣品所有SNP成功檢測數(shù)占總檢測數(shù)的比例[8]。設流行病學研究中常用的標準 95%成功率為界限[9]。

1.2.4 商業(yè)化SNP檢測法iPLEX：iPLEX GOLD技術可以設計最多達40重PCR反應和基因型檢測，實驗設計靈活，分型結果準確。提取血液(200 μL/assay)基因組DNA。通過探針設計軟件2.0版(Agena Bioscience，San Diego，CA; https://www.agenacx.com)設計G6PD基因的23個突變檢測的多重iPLEX反應引物，使用iPLEX市售試劑盒進行測定。以MassARRAY Typer分析儀軟件版本4.0(Agena Bioscience)分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.2.5 測序法檢測SNP：利用primer5軟件設計了覆蓋23個G6PD SNP位點序列的14條引物。提取樣品DNA，進行總體積為50 μL的PCR反應(0.4 μmol/L引物，25 μL Premix Taq，水和模板)。使用3730自動測序儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)對PCR產(chǎn)物進行Sanger測序。

1.2.6 方法評價：用本方法及市場上普遍使用的以血液為樣品的iPLEX技術對G6PD 23個SNP位點進行3 d、4個樣品、3個重復共828個反應的分型檢測，以測序法作為金標準比對?？煽啃砸越Y果可信度分別為A、B、C和D等級的檢測結果數(shù)占總檢測數(shù)的百分比來表示；重復性以3個重復孔分型結果均一致的檢測數(shù)占總檢測數(shù)的比例來表示；準確性以與測序結果一致的檢測數(shù)占該位點總檢測數(shù)的比例來表示。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 無創(chuàng)免核酸提取的基因分型檢測方法

結合質(zhì)譜技術對唾液與口腔咽拭子樣品SNP進行高通量檢測，建立的無創(chuàng)免核酸提取方法可成功對G6PD的23個SNP進行基因分型，成功率大于95%。

2.2 唾液樣品條件探索

2.2.1 反應所需最低樣品量：當樣品量大于18 μL時分型結果的成功率均為100%，盡管從這些樣品提取出的DNA含量波動很大(±50.8 ng)。當樣品量減少至10 μL時成功率則下降至95%以下。

2.2.2 樣品保存時間及保存方式：室溫保存至11周或-20 ℃保存4周的唾液樣品都可滿足實驗要求，分型結果的成功率均大于99%。

2.3 方法的可靠性、重復性及準確性評價

本方法低質(zhì)量分型結果(D:low probability)僅0.12%，以血液為樣品的iPLEX技術則為3.86%(圖1A)；在第2次重復測定時iPLEX與MELPA重復性有差異(P<0.01)(圖1B)；所有成功的分型結果中，本方法的分型結果都與測序結果相同。而iPLEX在159SNP位點上獲得正確的分型結果僅為52.8%，825位點則為0%(圖1C)。對比測序結果發(fā)現(xiàn)iPLEX會提供錯誤的雜合或半合子突變結果(表2，括號內(nèi)表示可信度等級)。

2.4 在瘧疾流行區(qū)G6PD基因突變檢測中的應用

篩查結果發(fā)現(xiàn)，這7例患者的G6PD均為野生型無突變，服用伯氨喹啉后進行定期隨訪亦未見該7例用藥的間日瘧患者發(fā)生溶血現(xiàn)象，即臨床表現(xiàn)符合本方法所得分型結果的基因表現(xiàn)型。

表1 唾液保存條件對分型結果的影響Table 1 Effect of saliva preservation conditions on genotyping results

A.call quality distribution; B.reproducibility of the genotype results for each assay on each day; C.genotyping call accuracy for the 23 G6PD SNP sites; *P<0.01 compared with MELPA in day 2

3 討論

本研究以無創(chuàng)性的唾液及口腔拭子為樣品，避免血液采集帶給受試者的不適感而拒絕采樣或者造成潛在病源傳播等缺陷；解決了基層大規(guī)模SNP篩查采樣時需要專業(yè)技術人員及特殊器材等問題；對保存條件要求不高(表1)，便于儲存及運輸。該法無需核酸提取，簡化了實驗操作、縮短了檢測時間、降低了檢測成本且在很大程度上解決了現(xiàn)有DNA提取技術中可能出現(xiàn)的樣品交叉污染，核酸質(zhì)量參差不齊等問題。

實際操作中唾液收集效果不確定，導致從唾液中提取出的DNA 量有所區(qū)別，從而出現(xiàn)不同實驗室或不同基因分型技術以唾液作為檢測樣品時所測得的結果及效果并不完全一致[10]。有時也因為樣品珍貴或者樣品量小而不能進行DNA提取。而本方法無需提取核酸，避免了因DNA提取帶來的含量及質(zhì)量的差異，將唾液裂解后直接進行檢測，經(jīng)過多次實驗(表1, 圖1)，不同人不同時間及不同質(zhì)量的唾液樣品，20 μL的樣品量足以滿足實驗要求。

相比于目前最為流行的商品化SNP分型檢測方法——以血液為樣品的iPLEX技術，本方法在可靠性、重復性方面的表現(xiàn)與之相當甚至更優(yōu)，在準確度上明顯高于iPLEX(圖1 )。iPLEX在159和825這2個位點的檢測上重復性較差，且會出現(xiàn)錯誤結果(表2)。

在測試本方法臨床應用的效果時，受試者均提供了口腔拭子樣品，該樣品采集后保存于離心管內(nèi)經(jīng)過郵寄到達北京進行檢測，直至檢測時該樣品在室溫存放了3周，顯示口腔拭子樣品可長期保存，對保存條件要求不高，并更易被受試者接受。

表2 兩種方法的差異結果Table 2 Discrepant results between two methods

本技術可成功進行人群G6PD突變篩查，對瘧疾流行區(qū)的等位基因突變頻率及伯氨喹啉用藥風險評估具有重要的意義。在精確醫(yī)學如靶向治療的藥物基因組學和突變檢測中，該方法將是一種大規(guī)模人群篩查的有用工具。